EXPERIMENTAL SECTIONGeneral Experim

EXPERIMENTAL SECTION
General Experimental Procedures. UV spectra were recorded
on a PerkinElmer Lambda 5 spectrophotometer. IR spectra were
recorded with a Nicolet FTIR 205 spectrophotometer. The NMR
spectra were recorded on a Bruker 500 MHz instrument (Avance 500)
for 1
H and 125 MHz for 13C using CDCl3 as solvent. HRESIMS was
run on a Thermoquest TLM LCQ Deca ion-trap spectrometer.
Figure 3. Docking conformations of compounds 1−4 (A−D) in the DYRK1A binding site. The conformation of harmine in the DYRK1A binding
site (X-ray diffraction, PDB 3ANR) is shown for comparison (E).
Journal of Natural Products Article
1120 dx.doi.org/10.1021/np400856h | J. Nat. Prod. 2014, 77, 1117−1122
Kromasil analytical and preparative C18 columns (250 × 4.6 mm and
250 × 21.2 mm; i.d. 5 μm, Thermo) were used for preparative HLPC
separations using a Waters autopurification system equipped with a
binary pump (Waters 2525), a UV−vis diode array detector (190−600
nm, Waters 2996), and a PL-ELS 1000 ELSD Polymer Laboratory
detector. Silica gel 60 (6−35 μm) and analytical and preparative TLC
plates (Si gel 60 F254) were purchased from SDS (France). A C18 140 g
Versapack cartridge was used for flash chromatography using a
Combiflash-Companion apparatus (Serlabo). All other chemicals and
solvents were purchased from SDS (France).
Plant Material. Glycosmis chlorosperma was collected in Keluang,
Johor Province, Malaysia, in July 2006. The plant was identified by T.
Leong Eng, Botanist, University of Malaya. A voucher specimen (KL-
5280) has been deposited at the Herbarium of the Department of
Chemistry, Faculty of Science, University of Malaya, Kuala Lumpur,
Malaysia.
Extraction and Isolation. The air-dried and powdered bark of G.
chlorosperma (1 kg) was extracted with EtOAc (3 × 1 L, 1 h each, 38
°C, 100 bar), using a Zippertex static high-pressure, high-temperature
extractor, developed in the ICSN Pilot Unit. The EtOAc crude extract
was concentrated in a vacuum at 40 °C to yield 9.4 g of residue. This
residue (8.9 g) was subjected to flash chromatography using a C18 140
g Versapack cartridge with a gradient of MeCN−H2O (20:80 to
100:0) at 20 mL/min to afford 12 fractions, F1−F12, according to
their TLC profiles. Fraction F6 (788 mg, IC50 0.23 μg/mL) was
subjected to silica gel column chromatography (CC) using a gradient
of CH2Cl2−MeOH (100:0−80:20) of increasing polarity, leading to
18 fractions (F1′−F18′) on the basis of TLC. Fraction F6′ (259 mg)
was subjected to silica gel CC using a gradient of CH2Cl2−MeOH
(100:0−80:20) to afford atalaphyllidine (3, 18.9 mg) and acrifoline (4,
6.7 mg). Fraction F10′ (16 mg) was subjected to preparative TLC
using the system EtOAc−CH2Cl2 (90:10) to afford chlorospermine B
(2, 2.5 mg). The purification of fraction F15′ (51 mg) using
preparative TLC with the solvent system EtOAc−MeOH (98:2)
afforded chlorospermine A (1, 3.5 mg).
Chlorospermine A (1): red, amorphous powder; UV (MeOH) λmax
(log ε) 275 (4.4) nm; IR νmax 3210, 1595, 1665, 1178, 833 cm−1
; 1
H
and 13C NMR data, see Table 1; HRESIMS m/z [M + H]+ 406.1656
(calcd for C24H24NO5, 406.1654).
Chlorospermine B (2): red, amorphous powder; UV (MeOH) λmax
(log ε) 273 (4.2), 399 (3.4) nm; IR νmax 3178, 1593, 1356, 1124, 833
cm−1
; 1
H and 13C NMR data, see Table 1; HRESIMS m/z [M + H]+
348.1238 (calcd for C21H18NO4, 348.1236).
Protein Kinase Assays. Buffers. Buffer A: 10 mM MgCl2, 1 mM
EGTA, 1 mM DTT, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 μg heparin/mL.
Buffer C: 60 mM ß-glycerophosphate, 30 mM p-nitrophenylphosphate,
25 mM Mops (pH 7.2), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl2, 1 mM
DTT, 0.1 mM sodium vanadate, 1 mM phenylphosphate.
Kinase Preparations and Assays. Native (CDK1, CK1, GSK-3)
and recombinant (CDK5, CLK1, DYRK1A) kinases were purified by
affinity chromatography. The active fractions were pooled, and
catalytic activity of each preparation was tested in the presence of
15 μM cold ATP (final concentration) supplemented with radiolabeled
ATP, using a range of volumes of each pooled fraction
preparation. The objective of this test was (1) to determine the specific
activity (listed in the legend of Table 2), (2) to ascertain that all
further assays would be run under linear conditions (thereby allowing
detection of linear inhibition), and (3) to ascertain that no more than
5−10% of the ATP substrate was consumed during the duration of the
assay (30 min). As the inhibitors were most likely acting by competing
at the ATP-binding site (as further supported by the modeling
experiments reported in Figure 3), a standard 15 μM ATP
concentration were used, which may not correspond to the optimal
concentration for each enzyme. However, this allows a fast screening
and unambiguous detection of ATP-competitive inhibitors. The IC50
values provided are thus relative values and should not be confused
with Ki values, which are absolute values, independent of the ATP
concentration. Kinase activities were assayed in buffer A or C, at 30
°C, at a final ATP concentration of 15 μM. Blank values were
subtracted and activities expressed in % of the maximal activity, i.e., in
the absence of inhibitors. Controls were performed with appropriate
dilutions of DMSO. The GSK-3, CK1, DYRK1a, and CLK1 peptide
substrates were obtained from Proteogenix (Oberhausbergen, France).
CDK1/cyclin B (M phase starfish oocytes, native) (0.1 μL active
kinase preparation/assay) and CDK5/p25 (1 μL active kinase
preparation/assay) were prepared as previously described.15,16 Their
kinase activity was assayed in buffer C, with 1 mg histone H1/mL, in
the presence of 15 μM [γ-
33P] ATP (3000 Ci/mmol; 10 mCi/mL) in
a final volume of 30 μL. After 30 min incubation at 30 °C, the reaction
was stopped by harvesting onto P81 phosphocellulose papers
(Whatman) using a FilterMate harvester (PerkinElmer), and the
products were washed in 1% phosphoric acid. Scintillation fluid was
added, and the radioactivity measured in a PerkinElmer counter. GSK-
3αβ (porcine brain, native) (1 μL active kinase preparation/assay) was
assayed, as described for CDK1 but in buffer A and using a GSK-3-
specific substrate (GS-1: YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE)
(pS stands for phosphorylated serine).17 Rat DYRK1A (vector kindly
provided by Dr. W. Becker, Institute for Pharmacology and
Toxicology, Aachen, Germany) (0.3 μL active kinase preparation/
assay) was purified by affinity chromatography on glutathione-agarose
and assayed in buffer A (+ 0.5 mg BSA/mL) using RS peptide
(GRSRSRSRSRSR) (1 μg/assay) as a substrate.18 CLK1 (mouse,
recombinant, expressed in E. coli as GST fusion protein) (1.4 μL active
kinase preparation/assay) was assayed in buffer A (+ 0.15 mg BSA/
mL) with RS peptide (GRSRSRSRSRSR) (1 μg/assay). CK1δ/ε
(porcine brain, native) (0.2 μL active kinase preparation/assay) was
assayed in 3-fold-diluted buffer C, as described for CDK1 but using 25
μM CKS peptide (RRKHAAIGpSAYSITA), a CK1-specific substrate.19
Molecular Modeling. Sequence alignments were generated using
ClustalX, version 2.0.20 Molecular docking calculations were carried
out using Gold 5.2,21 with the Goldscore scoring function and the
human DYRK1A protein structure (PDB code 3ANR22). Sequence
alignment between the rat DYRK1A (used for the protein kinase
assay) and the human DYRK1A (used for molecular docking) showed
that there were only three mutations between these two proteins, in
positions 32, 404, and 543 (Figure S1, see Supporting Information).
Residue 404 is distant from the binding site (more than 43 Å), and the
other two are toward the beginning and the end of the sequence, not
present in the protein structure used for the docking, implying that the
docking results can be reliably compared with the protein kinase assay
data. The binding site was defined as a sphere with 15 Å radius around
the CB atom of the “gatekeeper” Phe238 residue. Three-dimensional
coordinates of the ligands were obtained using Corina, version 3.44
(http://www.molecular-networks.com/). Images were generated using
PyMol version 1.6 (http://www.schrodinger.com/).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนการทดลองกระบวนการทดลองทั่วไป บันทึก UV แรมสเป็คตราในเครื่องทดสอบกรดด่าง PerkinElmer แลมบ์ดา 5 มี IR แรมสเป็คตราบันทึกไว้ ด้วยเครื่องทดสอบกรดด่างเป็น Nicolet FTIR 205 NMRแรมสเป็คตราถูกบันทึกไว้ในเครื่องมือ Bruker 500 MHz (Avance 500)สำหรับ 1H และ 125 MHz สำหรับ C 13 ใช้ CDCl3 เป็นตัวทำละลาย HRESIMS ถูกทำงานในการเดกา Thermoquest TLM LCQ ไอออนดักสเปกโตรมิเตอร์รูปที่ 3 เทียบ conformations ของสาร 1−4 (A−D) ในเว็บไซต์ DYRK1A รวม Conformation ของ harmine ในการรวม DYRK1Aไซต์ (เอ็กซ์เรย์การเลี้ยวเบน PDB 3ANR) จะแสดงสำหรับการเปรียบเทียบ (E)สมุดรายวันของบทความธรรมชาติ1120 ที่ dx.doi.org/10.1021/np400856h | เจผลิตภัณฑ์ nat. 2014, 77, 1117−1122Kromasil วิเคราะห์ และ preparative คอลัมน์ C18 (250 × 4.6 มม. และ250 × 21.2 mm ประชาชน 5 μm เทอร์โม) ใช้สำหรับ preparative HLPCใช้ระบบ autopurification น้ำเพียบพร้อมไปด้วยประโยชน์ปั๊มแบบไบนารี (น้ำ 2525), เป็น UV−vis ไดโอดอาร์เรย์จับ (190−600nm เตอร์ส 2996), และห้องปฏิบัติการพอลิเมอร์ ELSD PL-แล้ง 1000เครื่องตรวจจับ ซิลิก้าเจล 60 (6−35 μm) และวิเคราะห์ และ preparative TLCแผ่น (ซีเจล 60 F254) ถูกซื้อจาก SDS (ฝรั่งเศส) G C18 140ใช้ตลับหมึก Versapack chromatography แฟลชใช้กับเพื่อน Combiflash เครื่อง (Serlabo) สารเคมีอื่น ๆ และหรือสารทำละลายได้ซื้อจาก SDS (ฝรั่งเศส)วัสดุโรงงาน Glycosmis chlorosperma รวบรวมไว้ใน Keluangจังหวัดยะโฮร์ ประเทศมาเลเซีย กรกฎาคม 2549 โรงงานที่ระบุการยอมรับเข้า Eng, Botanist กอง ตัวอย่างสำคัญ (KL-5280) ได้รับการฝากไว้ที่หอพรรณไม้ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ กอง กัวลาลัมเปอร์มาเลเซียสกัดและแยก เปลือก air-dried และผงของกรัมchlorosperma (1 กิโลกรัม) ถูกสกัด ด้วย EtOAc (3 × 1 L, 1 ชั่วโมง 38° C, 100 บาร์), ใช้เป็น Zippertex คงปั้ม อุณหภูมิสูงระบาย พัฒนาในหน่วยนำร่อง ICSN สารสกัดหยาบ EtOAcเข้มข้นในสุญญากาศที่ 40 ° C ให้ 9.4 g ของสารตกค้าง นี้สารตกค้าง (8.9 กรัม) ถูกยัดเยียดให้แฟลชใช้ C18 140 chromatographyตลับ Versapack g ด้วยการไล่ระดับสีของ MeCN−H2O (20:80 ไป100:0) ที่ 20 mL/min ส่วน 12, F1−F12 ซื้อได้ตามโพรไฟล์ของ TLC เศษ F6 (788 มิลลิกรัม IC50 μg มล 0.23) ได้ต้องเจลคอลัมน์ chromatography (CC) ใช้การไล่ระดับสีของ CH2Cl2−MeOH (100:0−80:20) ของขั้วเพิ่มขึ้น นำไปส่วน 18 (F1′−F18′) โดยใช้ TLC F6′ เศษ (259 มิลลิกรัม)ซิลิก้าเจล CC ใช้การไล่ระดับสีของ CH2Cl2−MeOH ถูกต้อง(100:0−80:20) ซื้อได้ atalaphyllidine (3, 18.9 มิลลิกรัม) และ (4, acrifoline6.7 มิลลิกรัม) F10′ เศษส่วน (16 มิลลิกรัม) ถูกยัดเยียดให้ preparative TLCใช้ระบบ EtOAc−CH2Cl2 (90:10) chlorospermine B ซื้อได้(2, 2.5 mg) ฟอกเศษ F15′ (51 มิลลิกรัม) โดยใช้TLC preparative ด้วยระบบตัวทำละลาย EtOAc−MeOH (98:2)นี่ chlorospermine A (1, 3.5 มิลลิกรัม)A Chlorospermine (1): สีแดง ไปผง Λmax UV ทานอ)(ล็อกε) 275 (4.4) nm IR νmax 3210, 1595, 1665, 1178, 833 cm−1; 1Hและ 13C NMR ข้อมูล ดูตารางที่ 1 HRESIMS m/z [M + H] + 406.1656(ปีสำหรับ C24H24NO5, 406.1654)บี Chlorospermine (2): สีแดง ไปผง Λmax UV ทานอ)(ล็อกε) 273 (4.2) 399 (3.4) nm IR νmax 3178, 1593, 1356, 1124, 833cm−1; 1ตารางที่ 1 ดูข้อมูล NMR H และ 13C HRESIMS m/z [M + H] +348.1238 (ปีสำหรับ C21H18NO4, 348.1236)โปรตีน Kinase Assays บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์ a: MgCl2 10 mM, 1 mMEGTA, 1 mM DTT, 25 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 7.5, 50 μg เฮพา ริน/mLบัฟเฟอร์ c: 60 มม.บาท-glycerophosphate, 30 มม. p-nitrophenylphosphate25 มม. Mops (pH 7.2), 5 mM EGTA, mM 15 MgCl2, 1 mMDTT, vanadate โซเดียม 0.1 mM, phenylphosphate 1 mMเตรียม kinase และ Assays พื้นเมือง (CDK1, CK1, GSK-3)และ kinases วททช (CDK5, CLK1, DYRK1A) ที่บริสุทธิ์ด้วยความสัมพันธ์ chromatography ส่วนใช้งานอยู่ถูกทางถูกพู และทดสอบกิจกรรมตัวเร่งปฏิกิริยาเตรียมแต่ละหน้าRadiolabeled 15 μM เย็น ATP (ความเข้มข้นสุดท้าย) เสริมด้วยATP โดยใช้ช่วงของไดรฟ์ข้อมูลของทุกฝ่ายรวมการเตรียมการ วัตถุประสงค์ของการทดสอบนี้คือ (1) การกำหนดเฉพาะกิจกรรม (แสดงในตำนานของตารางที่ 2), (2) การตรวจที่ทั้งหมดต่อไป จะรัน assays ภายใต้เงื่อนไขเชิงเส้น (จึงทำให้ตรวจสอบยับยั้งเส้น), และ (3) การตรวจที่ไม่เกิน5−10% ของพื้นผิว ATP ถูกใช้ในระหว่างระยะเวลาของการวิเคราะห์ (30 นาที) เป็น inhibitors ที่ถูกมักทำหน้าที่ โดยการแข่งขันที่ไซต์ ATP รวม (เพิ่มเติมเป็นได้รับการสนับสนุน โดยการสร้างโมเดลทดลองรายงานในรูปที่ 3), ATP เป็น 15 μM มาตรฐานความเข้มข้นใช้ ซึ่งอาจไม่ตรงกับดีที่สุดความเข้มข้นเอนไซม์แต่ละ อย่างไรก็ตาม นี้ช่วยให้การคัดกรองอย่างรวดเร็วและ ATP แข่งขัน inhibitors ตรวจชัดเจน IC50ค่าให้เป็นค่าสัมพัทธ์ดังนั้น และไม่ควรสับสนมีค่ากี่ ที่มีค่า อิสระของ ATPความเข้มข้น กิจกรรม kinase ได้ assayed ในบัฟเฟอร์ A หรือ C ที่ 30° C ที่ ATP เข้มข้นสุดท้ายของ 15 μM ค่าว่างได้ลบ และกิจกรรมแสดง%ของกิจกรรมสูงสุด เช่น ในการขาดงาน inhibitors ดำเนินการควบคุม มีความเหมาะสมdilutions ของ DMSO เพปไทด์ GSK 3, CK1, DYRK1a และ CLK1พื้นผิวได้รับจาก Proteogenix (Oberhausbergen ฝรั่งเศส)B CDK1/cyclin (M ระยะ starfish แช่สารละลาย พื้นเมือง) (0.1 μL ใช้งานอยู่เตรียม kinase/วิเคราะห์) และ CDK5 (1 μL งาน kinase p25เตรียม/วิเคราะห์) ถูกเตรียมไว้เป็น described.15,16 ก่อนหน้านี้ของพวกเขากิจกรรม kinase ที่ assayed ในบัฟเฟอร์ซี กับฮิสโตน 1 มิลลิกรัม H1/mL ในของ μM 15 [γ-ATP 33 P] (3000 Ci mmol; 10 mCi mL) ในมีปริมาตรสุดท้ายของ 30 μL หลังจากฟักตัว 30 นาทีที่ 30 ° C ปฏิกิริยาได้หยุดลง โดยเก็บเกี่ยวลงบนกระดาษ phosphocellulose P81(Whatman) ใช้เก็บเกี่ยว FilterMate (PerkinElmer), และผลิตภัณฑ์ถูกล้างในกรดฟอสฟอริก 1% Scintillation น้ำมันถูกเพิ่ม และเคาน์เตอร์ PerkinElmer radioactivity ที่วัด GSK-3αβ (ช่วงสมอง พื้นเมือง) ถูก (1 μL kinase งานเตรียม/ทดสอบ)assayed ตาม CDK1 แต่ ในบัฟเฟอร์ A และใช้ GSK เป็น-3 -พื้นผิวเฉพาะ (GS 1: YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE)(pS ถึงแถ phosphorylated) .17 DYRK1A ราษฎร์ (เวกเตอร์กรุณาโดยดร. W. Becker สถาบันเภสัชวิทยา และพิษวิทยา Aachen เยอรมนี) (0.3 μL kinase งานเตรียม /ทดสอบ) ที่บริสุทธิ์ โดย chromatography ความสัมพันธ์บน agarose กลูตาไธโอนและ assayed ในบัฟเฟอร์ A (+ 0.5 mg/mL บีเอสเอ) ใช้เอสเพปไทด์(GRSRSRSRSRSR) (1 μg/วิเคราะห์) เป็น substrate.18 CLK1 (เมาส์recombinant แสดงใน E. coli เป็นโปรตีน GST ฟิวชั่น) (1.4 μL ใช้งานอยู่เตรียม/วิเคราะห์ kinase) ถูก assayed ในบัฟเฟอร์ A (+ 0.15 mg บีเอสเอ /มล.) กับเพปไทด์ RS (GRSRSRSRSRSR) (1 μg/วิเคราะห์) CK1Δ/Ε(ช่วงสมอง พื้นเมือง) (0.2 μL kinase งานเตรียม/วิเคราะห์) ได้assayed ใน 15.00-fold-ผสมบัฟเฟอร์ C อธิบายไว้ใน CDK1 แต่ใช้ 25เพปไทด์ CKS μM (RRKHAAIGpSAYSITA), substrate.19 เฉพาะ CK1โมเดลระดับโมเลกุล จัดลำดับแนวสร้างขึ้นโดยใช้ClustalX รุ่น 2.0.20 ได้ดำเนินการคำนวณต่อโมเลกุลออกใช้ทอง 5.2,21 กับ Goldscore ฟังก์ชันการให้คะแนนและมนุษย์ DYRK1A โปรตีนโครงสร้าง (PDB รหัส 3ANR22) ลำดับตำแหน่งระหว่างหนู DYRK1A (ใช้สำหรับ kinase โปรตีนทดสอบ) และการมนุษย์ DYRK1A (ใช้สำหรับเทียบโมเลกุล) แสดงให้เห็นว่าที่มีอยู่เพียงสามกลายพันธุ์ระหว่างโปรตีนเหล่านี้สองตำแหน่งที่ 32, 404 และ 543 (รูป S1 ดูข้อมูลสนับสนุน)สารตกค้าง 404 อยู่ห่างจากเว็บไซต์รวม (มากกว่า 43 Å), และอีกสองไม่ไปเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับในโครงสร้างโปรตีนที่ใช้ในการเทียบ หน้าที่ที่เทียบผลสามารถได้เปรียบเทียบกับโปรตีน kinase วิเคราะห์ข้อมูล รวมเว็บไซต์ถูกกำหนดเป็นทรงกลมมี 15 Åรัศมีรอบ ๆอะตอม CB ของสารตกค้าง "gatekeeper" Phe238 สามมิติพิกัดของ ligands ได้รับโดยใช้ฮอสโคริน่า รุ่น 3.44(http://www.molecular-networks.com/) ภาพที่สร้างขึ้นโดยใช้PyMol รุ่น 1.6 (ส่วน http://www.schrodinger.com/)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ทดลองวนขั้นตอนการทดลองทั่วไป สเปกตรัมรังสียูวีที่ถูกบันทึกไว้ใน PerkinElmer แลมบ์ดา 5 spectrophotometer
IR
สเปกตรัมถูกบันทึกด้วยเลFTIR 205 spectrophotometer NMR
สเปกตรัมที่ถูกบันทึกไว้ใน Bruker 500 MHz เครื่องดนตรี (Avance 500)
1
H และ 125 MHz สำหรับ 13C ใช้ CDCl3 เป็นตัวทำละลาย HRESIMS
ได้ทำงานบนThermoquest TLM LCQ Deca สเปกโตรมิเตอร์ไอออนกับดัก.
รูปที่ 3 conformations เชื่อมต่อของสาร 1-4 (A-D) ในเว็บไซต์ DYRK1A ผูกพัน โครงสร้างของ harmine ใน DYRK1A
ผูกพันเว็บไซต์(X-ray diffraction, PDB 3ANR) จะแสดงการเปรียบเทียบ (E).
วารสารผลิตภัณฑ์ธรรมชาติมาตรา
1120 dx.doi.org/10.1021/np400856h | ชัยนาทเจ แยง 2014, 77, 1117-1122
Kromasil วิเคราะห์และเตรียมคอลัมน์ C18 (250 × 4.6 มิลลิเมตรและ
250 × 21.2 มมรหัส 5 ไมครอนเทอร์โม) ถูกนำมาใช้สำหรับ HLPC
เตรียมแยกโดยใช้ระบบautopurification
น้ำติดตั้งเครื่องสูบน้ำไบนารี(น้ำ 2525) เป็น UV-Vis ตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด (190-600
นาโนเมตรน้ำ 2996) และ PL-ELS 1000 ELSD
ห้องปฏิบัติการพอลิเมอตรวจจับ ซิลิก้าเจล 60 (6-35 ไมครอน) และ TLC
วิเคราะห์และเตรียมแผ่น(ศรีเจล 60 F254) ที่ซื้อมาจาก SDS (ฝรั่งเศส) C18 140
กรัมตลับVersapack
ใช้สำหรับโคแฟลชใช้อุปกรณ์Combiflash-Companion (Serlabo) สารเคมีอื่น ๆ
ทั้งหมดและตัวทำละลายที่ซื้อมาจากSDS (ฝรั่งเศส).
โรงงานวัสดุ Glycosmis chlorosperma ถูกเก็บใน Keluang,
ยะโฮร์จังหวัดมาเลเซียในเดือนกรกฎาคมปี 2006 โรงงานถูกระบุโดย T.
Leong Eng, พฤกษศาสตร์, University of Malaya ตัวอย่างบัตรกำนัล (KL-
5280) ได้รับการฝากไว้ที่หอพรรณไม้ของกรมวิชาเคมีคณะวิทยาศาสตร์มหาวิทยาลัยมลายากัวลาลัมเปอร์มาเลเซีย. การสกัดและการแยก อากาศแห้งและผงเปลือกของจีchlorosperma (1 กิโลกรัม) ถูกสกัดด้วย EtOAc (3 × 1 ลิตร, 1 ชั่วโมงแต่ละ 38 ° C, 100 บาร์) โดยใช้ Zippertex คงแรงดันสูงที่อุณหภูมิสูงระบายการพัฒนาในหน่วยนักบิน ICSN สารสกัดหยาบ EtOAc เข้มข้นในสูญญากาศที่ 40 ° C ถึงผลผลิต 9.4 กรัมของสารตกค้าง นี้ตกค้าง (8.9 กรัม) ถูกยัดเยียดให้แฟลชโคใช้ C18 140 กรัมตลับ Versapack ที่มีความลาดชัน MeCN-H2O (ที่ 20:80 ไป100: 0) 20 มิลลิลิตร / นาทีจ่าย 12 เศษส่วน F1-F12 ตามโปรไฟล์ TLC ของพวกเขา F6 ส่วน (788 มก., IC50 0.23 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) ถูกยัดเยียดให้คอลัมน์ซิลิกาเจล(ซีซี) โดยใช้การไล่ระดับสีของCH2Cl2-เมธานอล (100: 0-80: 20) ของกระแสไฟฟ้าที่เพิ่มขึ้นนำไปสู่​​18 เศษส่วน (F1'- F18) บนพื้นฐานของ TLC ส่วน F6 (259 มก.) ก็จะถูกซิลิก้าเจลซีซีโดยใช้การไล่ระดับสีของ CH2Cl2-เมธานอล(100: 0-80: 20) ที่จะจ่าย atalaphyllidine (3, 18.9 มก.) และ acrifoline (4, 6.7 มก.) ส่วน F10 '(16 มก.) ได้ภายใต้การเตรียม TLC โดยใช้ระบบ EtOAc-CH2Cl2 (90:10) ที่จะจ่าย chlorospermine B (2, 2.5 มก.) การทำให้บริสุทธิ์ของส่วน F15 (51 มก.) โดยใช้เตรียมเอาใจใส่กับระบบตัวทำละลายEtOAc-เมธานอล (98: 2) อึด chlorospermine A (1, 3.5 มก.). Chlorospermine A (1): สีแดง, ผงป่น; รังสียูวี (เมธานอล) λmax (log ε) 275 (4.4) นาโนเมตร; IR νmax 3210, 1595, 1665, 1178, 833 ซม. 1; 1 H และ 13C NMR ข้อมูลดูตารางที่ 1; HRESIMS เมตร / z [M + H] + 406.1656 (calcd สำหรับ C24H24NO5, 406.1654). Chlorospermine B (2): สีแดง, ผงป่น; รังสียูวี (เมธานอล) λmax (log ε) 273 (4.2) 399 (3.4) นาโนเมตร; IR νmax 3178, 1593, 1356, 1124, 833 ซม. 1; 1 H และ 13C NMR ข้อมูลดูตารางที่ 1; HRESIMS เมตร / z [M + H] + 348.1238 (calcd สำหรับ C21H18NO4, 348.1236). โปรตีนไคเนสตรวจ บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์: 10 มิลลิ MgCl2 1 มิลลิEGTA 1 มิลลิ DTT 25 มิลลิ Tris-HCl pH 7.5 50 ไมโครกรัมเฮ / mL. บัฟเฟอร์ C: 60 มิลลิ SS-glycerophosphate 30 มิลลิพี nitrophenylphosphate, 25 มิลลิ Mops (pH 7.2 ) 5 มิลลิ EGTA 15 มิลลิ MgCl2 1 มิลลิDTT 0.1 มิลลิโซเดียมวานาเดต 1 มิลลิ phenylphosphate. ไคเนสเตรียมและตรวจ พื้นเมือง (Cdk1, CK1, GSK-3) และ recombinant (CDK5, clk1, DYRK1A) ไคเนสส์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิด โดยเศษที่ใช้งานถูกรวบรวมและเร่งปฏิกิริยาในการจัดทำแต่ละได้รับการทดสอบในการปรากฏตัวของ15 ไมครอนเย็นเอทีพี (ความเข้มข้นสุดท้าย) เสริมด้วย radiolabeled เอทีพีใช้ช่วงของปริมาณของแต่ละส่วน pooled เตรียม วัตถุประสงค์ของการทดสอบนี้คือ (1) เพื่อตรวจสอบเฉพาะกิจกรรม(ระบุไว้ในตำนานของตารางที่ 2), (2) เพื่อให้แน่ใจว่าทุกการตรวจต่อไปจะทำงานภายใต้เงื่อนไขเชิงเส้น(ซึ่งจะช่วยให้การตรวจสอบของการยับยั้งการเชิงเส้น) และ ( 3) เพื่อให้แน่ใจว่าไม่เกิน 5-10% ของพื้นผิวเอทีพีได้รับการบริโภคในช่วงระยะเวลาของการทดสอบ(30 นาที) ในฐานะที่เป็นสารยับยั้งได้ส่วนใหญ่จะทำหน้าที่โดยการแข่งขันได้ที่เว็บไซต์เอทีพีผูกพัน(ตามที่ได้รับการสนับสนุนต่อไปโดยการสร้างแบบจำลองการทดลองรายงานในรูปที่3) มาตรฐาน 15 ไมครอนเอทีพีเข้มข้นถูกนำมาใช้ซึ่งอาจไม่ตรงกับที่ดีที่สุดเข้มข้นสำหรับแต่ละเอนไซม์ แต่นี้จะช่วยให้การตรวจคัดกรองอย่างรวดเร็วและการตรวจสอบที่ชัดเจนของสารยับยั้งการแข่งขันเอทีพี ค่า IC50 ค่าจึงให้ค่าญาติและไม่ควรจะสับสนกับค่ากิซึ่งเป็นค่าที่แน่นอนอิสระของเอทีพีเข้มข้น กิจกรรมไคเนสถูก assayed ในบัฟเฟอร์หรือซีวันที่ 30 องศาเซลเซียสที่ความเข้มข้นสุดท้ายของเอทีพี 15 ไมครอน ค่าที่ว่างเปล่าถูกหักออกและกิจกรรมที่แสดงใน% ของกิจกรรมสูงสุดคือในกรณีที่ไม่มีโปรตีน การควบคุมการดำเนินการที่เหมาะสมกับการเจือจางของ DMSO GSK-3, CK1, DYRK1a และเปปไทด์ clk1 พื้นผิวที่ได้รับจาก Proteogenix (Oberhausbergen ฝรั่งเศส). Cdk1 / cyclin B (M ไข่เฟสปลาดาวพื้นเมือง) (0.1 ไมโครลิตรใช้งานเตรียมไคเนส/ ทดสอบ) และ CDK5 / P25 (1 ไคเนสไมโครลิตรใช้งานการเตรียม/ ทดสอบ) ได้จัดทำไว้ก่อนหน้านี้ของพวกเขา described.15,16 กิจกรรมไคเนสได้รับการวิเคราะห์ในบัฟเฟอร์ซี 1 มกสโตน H1 / มิลลิลิตรในการปรากฏตัวของ15 ไมครอนเมื่อ [γ- 33p] เอทีพี (3000 Ci / มิลลิโมล 10 มิลลิ / มิลลิลิตร) ในปริมาณที่สุดท้ายของวันที่30 ไมโครลิตร หลังจาก 30 นาทีบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสปฏิกิริยาหยุดการเก็บเกี่ยวบนเอกสารP81 phosphocellulose (เบอร์) โดยใช้เครื่องเกี่ยวนวด FilterMate (PerkinElmer) และผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการล้างในกรดฟอสฟอรัส1% ของเหลวประกายได้เพิ่มและวัดกัมมันตภาพรังสีในเคาน์เตอร์ PerkinElmer GSK- 3αβ (สมองหมูพื้นเมือง) (1 ไมโครลิตรไคเนสที่ใช้งานการเตรียม / ทดสอบ) ถูกassayed ตามที่อธิบายไว้สำหรับ Cdk1 แต่ในบัฟเฟอร์และใช้ GSK-3 พื้นผิวที่เฉพาะเจาะจง (GS-1: YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE) (PS ย่อมาจาก phosphorylated ซีรีน) 0.17 หนู DYRK1A (เวกเตอร์กรุณาให้โดยดร. ดับบลิวเบกเกอร์สถาบันเภสัชวิทยาและพิษวิทยา, อาเค่น, เยอรมนี) (0.3 ไมโครลิตรไคเนสที่ใช้งานการเตรียม / ทดสอบ) ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยสารกลูตาไธโอนในความสัมพันธ์-agarose และ assayed ในบัฟเฟอร์ (+ 0.5 มก. บีเอสเอ / มิลลิลิตร) ใช้เปปไทด์อาร์เอส(GRSRSRSRSRSR) (1 ไมโครกรัม / ทดสอบ) เป็น clk1 substrate.18 (เมาส์, recombinant แสดงออกในเชื้อ E. coli เป็นฟิวชั่นโปรตีน GST) (1.4 ไมโครลิตรใช้งานเตรียมไคเนส/ ทดสอบ) ได้รับการวิเคราะห์ในบัฟเฟอร์ (+ 0.15 มก. บีเอสเอ / มิลลิลิตร) เปปไทด์กับอาร์เอส (GRSRSRSRSRSR) (1 ไมโครกรัม / ทดสอบ) CK1δ / ε (สมองหมูพื้นเมือง) (0.2 ไมโครลิตรไคเนสที่ใช้งานการเตรียม / ทดสอบ) ถูกassayed ใน 3 เท่าปรับลดบัฟเฟอร์ C ตามที่อธิบายไว้สำหรับ Cdk1 แต่ใช้ 25 เปปไทด์ไมโครโม CKS (RRKHAAIGpSAYSITA) ซึ่งเป็น substrate.19 CK1 เฉพาะการสร้างแบบจำลองโมเลกุล การจัดแนวลำดับที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ClustalX รุ่น 2.0.20 การคำนวณเชื่อมต่อโมเลกุลได้ดำเนินการโดยใช้ทอง5.2,21 กับฟังก์ชั่นการให้คะแนน Goldscore และโครงสร้างโปรตีนDYRK1A มนุษย์ (รหัส PDB 3ANR22) ลำดับการจัดตำแหน่งระหว่าง DYRK1A หนู (ใช้สำหรับโปรตีนไคเนสทดสอบ) และ DYRK1A มนุษย์ (ใช้สำหรับเชื่อมต่อโมเลกุล) แสดงให้เห็นว่ามีเพียงสามกลายพันธุ์ระหว่างทั้งสองโปรตีนในตำแหน่งที่32, 404 และ 543 (รูปที่ S1 ดูที่สนับสนุน ข้อมูล). กาก 404 อยู่ห่างจากเว็บไซต์ที่มีผลผูกพัน (มากกว่า 43) และอีกสองคนไปยังจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับที่ไม่อยู่ในโครงสร้างของโปรตีนที่ใช้สำหรับการเชื่อมต่อหมายความว่าผลการเชื่อมต่อสามารถนำมาเปรียบเทียบน่าเชื่อถือกับโปรตีนไคเนสทดสอบข้อมูล เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันถูกกำหนดเป็นทรงกลมที่มีรัศมี 15 รอบอะตอมCB ของ "ยาม" สารตกค้าง Phe238 สามมิติพิกัดของแกนด์ที่ได้รับโดยใช้โคริ, รุ่น 3.44 (http://www.molecular-networks.com/) ภาพที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้รุ่น PyMol 1.6 (http://www.schrodinger.com/)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทดลองส่วน
ทั่วไปทดลองวิธี แสง UV ถูกบันทึกไว้
บน Perkinelmer แลมบ์ดา 5 วัสดุ IR spectra ถูกบันทึกไว้ด้วย
nicolet FTIR 205 วัสดุ ที่ถูกบันทึกไว้ในสเปกตรัม NMR
BRUKER 500 MHz เครื่องมือ ( วนซ์ 500 )
1
H และ 125 MHz สำหรับใช้ cdcl3 13C เป็นตัวทำละลาย hresims คือ
วิ่งบน thermoquest คนค lcq เดกาไอออนกับดักสเปกโตรมิเตอร์
รูปที่ 3สำหรับโครงสร้างของสารประกอบ 1 − ( − 4 D ) ใน dyrk1a ผูกพันเว็บไซต์ โครงสร้างของ harmine ใน dyrk1a ผูกพัน
เว็บไซต์ ( เทคนิคการเลี้ยวเบนรังสีเอ็กซ์ PDB 3anr ) ที่แสดงการเปรียบเทียบ ( E )
วารสารบทความ
ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติสุด dx.doi.org/10.1021/np400856h | เจ. ชัยนาท แยง 2014 , 77 , 1117 − 1122
kromasil วิเคราะห์และเตรียมคอลัมน์ c18 ( 250 × 4.6 mm
250 × 21.2 มิลลิเมตร ; บัตร 5 μ Mเทอร์โม ) ใช้สำหรับแยก hlpc
= ใช้ระบบน้ำ autopurification พร้อมกับ
ปั๊มไบนารี ( น้ำ 2525 ) , UV Vis ไดโอด− ( − 600
อาร์เรย์เครื่อง 190 นาโนเมตร น้ำ 1 ) และ pl-els 1000 elsd ห้องปฏิบัติการ
พอลิเมอร์เครื่องตรวจจับ ซิลิกาเจล 60 ( 6 − 3 μ M ) และวิเคราะห์และเตรียมแผ่น TLC
( ศรีเจล 60 f254 ) ซื้อจาก SDS ( ฝรั่งเศส ) เป็น c18 140 g
versapack ตลับใช้วิธีแฟลชโดยใช้เครื่องมือสหาย
combiflash ( serlabo ) สารเคมีอื่น ๆทั้งหมดและ
ตัวทำละลายซื้อจาก SDS ( ฝรั่งเศส )
วัสดุพืช glycosmis chlorosperma เก็บข้อมูลใน keluang
ยะโฮร์ , จังหวัด , มาเลเซีย , กรกฎาคม 2006 พืชที่ถูกระบุโดย T .
Leong ม. นักพฤกษศาสตร์ , มหาวิทยาลัยมาลายา คูปองตัวอย่าง ( KL -
สาวโตเกียวได้รับฝากไว้ที่หอพรรณไม้กรม
ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมาลายา ประเทศมาเลเซีย กัวลาลัมเปอร์
.
การสกัดและการแยก . อากาศแห้งและเปลือกผง g .
chlorosperma ( 1 กก. ) ถูกสกัดด้วย etoac ( 3 × 1 ลิตร 1 H แต่ละ 38
° C 100 บาร์ ) ใช้ zippertex ไฟฟ้าสถิตแรงดันสูง อุณหภูมิสูง
Extractor , พัฒนาใน icsn นักบินหน่วยการ etoac สกัด
ข้นในสูญญากาศที่อุณหภูมิ 40 องศา C ถึงผลผลิต 9.4 กรัม กาก กากนี้
( 8.9 กรัม ) คือต้องใช้แฟลชแยก c18 140
g ตลับ versapack มีความลาดชัน mecn − H2O ( 100 : 0 :

) 20 มิลลิลิตรต่อนาทีจ่าย 12 เศษส่วน F1 − F12 ตาม
ของ TLC โปรไฟล์ ส่วน F6 ( 788 ic50 0.23 มิลลิกรัมμ g / ml ) คือ
ภายใต้ซิลิกาเจลคอลัมน์โครมาโตกราฟฟี ( CC ) โดยใช้การไล่ระดับของปริมาณ ( 100 : 0
ch2cl2 −− 80 : 20 ) การจ า

18 เศษส่วน ( F1 ′− F18 School ) บนพื้นฐานของ TLC . ส่วนนั้น ( 259 มิลลิกรัม ) F6
ภายใต้ CC ซิลิกาเจลโดยใช้การไล่ระดับของปริมาณ ch2cl2 − ( − 80 100 : 0
) ซื้อ ( 3 atalaphyllidine 18.9 มิลลิกรัม ) และ acrifoline ( 4
6.7 มิลลิกรัม )ส่วน F10 นั้น ( 16 มิลลิกรัม ) ภายใต้ค่า TLC
โดยใช้ระบบ etoac − ch2cl2 ( รูป ) สามารถ chlorospermine b
2 , 2.5 มิลลิกรัม ) การทำให้บริสุทธิ์ของเศษส่วน f15 MBC ( 51 มิลลิกรัม ) ใช้กับตัวทำละลาย (
= ระบบ etoac −เมทิลแอลกอฮอล์ ( 98:2 )
เจ้าตัว chlorospermine ( 1 , 3.5 มก. )
chlorospermine ( 1 ) : แดง , ผงป่น ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์
( log ε ) 275 ( 4.4 ) nm ; และขอให้νสูงสุด 73 , 620 1665 , , ,833 cm − 1
1
H
13C NMR และข้อมูล เห็นตารางที่ 1 ; hresims M / Z [ M ] 406.1656
( Calcd สำหรับ c24h24no5 406.1654 , )
chlorospermine B ( 2 ) : แดง , ผงป่น ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์
( log ε ) 273 ( 4.2 ) 399 ( 3.4 ) nm ; และνแม็กซ์ 3178 1551 , 1356 , โดย , , , cm − 1 ที

; 1
H และ 13C NMR เห็นข้อมูล , ตารางที่ 1 ; hresims M / Z [ M ]
348.1238 ( Calcd สำหรับ c21h18no4 348.1236 , )
) โปรตีนไคเนส . บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์ :ชุด 10 มม. หน่วย 1 mM DTT
1 มม. 25 มม. นอกจากนี้ กรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 50 กรัม / มิลลิลิตรμ heparin
buffer C : 60 มม. ß - glycerophosphate p-nitrophenylphosphate , 30 มม.
25 มม. ไม้ถูพื้น ( pH 7.2 ) หน่วย 5 มม. 15 มม. 20 มม. ชุด 1
, การทำงาน , โซเดียม 0.1 มิลลิเมตร phenylphosphate 1 mm .
การเตรียมไคเนส ) และ . พื้นเมือง ( cdk1 , CK1 , gsk-3 )
~ i ( cdk5 clk1 , และ , ยา dyrk1a ) ถูกทำให้บริสุทธิ์ โดย
ขี้รังแค .เศษส่วนปราดเปรียวถูก pooled และ
ฤทธิ์ของแต่ละเตรียมทดสอบต่อหน้า
15 μ M เย็นเอทีพี ( ความเข้มข้นสุดท้าย ) เสริมด้วย radiolabeled
เอทีพีโดยใช้ช่วงของปริมาณรวมของแต่ละส่วน
การเตรียม วัตถุประสงค์ของการทดสอบนี้คือ ( 1 ) เพื่อศึกษากิจกรรมที่เฉพาะเจาะจง
( จดทะเบียนในตำนานของตาราง 2 ) , ( 2 ) การวินิจฉัยทั้งหมด
พยายามต่อไปจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเชิงเส้น ( linear จึงให้
ตรวจจับการยับยั้ง ) และ ( 3 ) เพื่อให้แน่ใจว่าไม่เกิน
5 − 10 % ของเอทีพี ( ถูกใช้ในช่วงระยะเวลาของ
assay ( 30 นาที ) เป็นสารยับยั้งและส่วนใหญ่ทำโดยแข่งขัน
ที่เอทีพีเว็บไซต์ ( เช่นการการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยแบบจำลอง
การทดลองรายงานในรูปที่ 3 )มาตรฐาน 15 μ M เอทีพี
ความเข้มข้นที่ใช้ ซึ่งอาจไม่สอดคล้องกับความเข้มข้นที่เหมาะสม
แต่ละเอนไซม์ อย่างไรก็ตาม , นี้จะช่วยคัดกรองและการตรวจหา ATP รวดเร็ว
แข่งขันยับยั้งชัดเจน . การ ic50
ค่าให้เป็นค่าสัมพัทธ์ และไม่ควรจะสับสนกับคิ
ค่า ซึ่งเป็นค่าสัมบูรณ์ , อิสระของเอทีพี
ความเข้มข้นกิจกรรมไคเนสเป็นเอนไซม์ในบัฟเฟอร์หรือ C 30
° C มีความเข้มข้นเอทีพีสุดท้าย 15 μม. ว่างค่า
หักออกและกิจกรรมแสดงออกใน % ของกิจกรรมสูงสุดคือใน
ไม่มีตัวยับยั้ง การควบคุมการใช้วิธีการ DMSO
. การ gsk-3 , CK1 , dyrk1a และ clk1 เปปไทด์
พื้นผิวที่ได้จาก proteogenix
( Oberhausbergen , ฝรั่งเศส )ลักษณะ cdk1 / B ( M ปลาดาว ระยะไข่ , พื้นเมือง ) ( 0.1 μ L ปราดเปรียว
kinase การเตรียม / assay ) และ cdk5 / p25 ( 1 μ L ปราดเปรียว kinase
เตรียม / assay ) เตรียมของตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 15,16
ไคเนสกิจกรรมซีรั่มในบัฟเฟอร์ ซี กับ 1 มก. ช่วย H1 / ml ใน
มี 15 μ M [ γ -
33p ] เอทีพี ( 3000 CI / มิลลิโมล ; MCI / 10 มล. ) ใน
ปริมาณสุดท้าย 30 μลิตรหลังจาก 30 นาทีบ่มที่ 30 ° Cปฏิกิริยา
ถูกหยุดโดยการเก็บเกี่ยวบน p81 phosphocellulose เอกสาร
( whatman ) โดยใช้ filtermate เก็บเกี่ยว ( Perkinelmer ) และ
ผลิตภัณฑ์ล้าง 1% กรดฟอสฟอริก แสงของเหลว
เพิ่มและกัมมันตภาพรังสีที่วัดได้ใน Perkinelmer เคาน์เตอร์ ซ -
3 αβ ( สมอง , สุกรพื้นเมือง ) ( 1 μ L ปราดเปรียว ไคเนส การเตรียมการทดสอบ / ml )
,ตามที่อธิบายไว้ใน cdk1 แต่ในบัฟเฟอร์และใช้ gsk-3 -
พื้นผิวที่เฉพาะเจาะจง ( GS - 1 : yrraavppspslsrhssphqspedeee )
( ป.ล. ย่อมาจากฟอสฟอรีเลเตตเอนไซม์ ) . 17 หนู dyrk1a ( เวกเตอร์กรุณา
โดยดร. ดับบลิว เบคเกอร์ และ สถาบันเภสัชวิทยา
พิษวิทยา อาเคน , เยอรมนี ) ( 0.3 μ L /
) การเตรียมใช้งาน ไคเนส ) คือบริสุทธิ์โดยขี้รังแคบนกลูต้าโรส
และ ปริมาณในบัฟเฟอร์ ( 0.5 mg / ml โดยใช้เปปไทด์ ( RS )
( grsrsrsrsrsr ) ( 1 μ g / ( ) เป็น substrate.18 clk1 ( เมาส์
ยีนที่แสดงออกใน E . coli เป็น GST ของโปรตีน ) ( 1.4 μ l งานเตรียม /
kinase assay ) ซีรั่มในบัฟเฟอร์ ( 0.15 มก. /
( มิลลิลิตร ) กับอาร์เอส เปปไทด์ ( grsrsrsrsrsr ) ( 1 μกรัม / 3 ) CK1 δ / ε
( สมอง , สุกรพื้นเมือง ) ( 0.2 μ L ปราดเปรียว ไคเนส การเตรียมการทดสอบ
/ )เอนไซม์ใน 3-fold-diluted บัฟเฟอร์ซี อธิบายว่า สำหรับ cdk1 แต่ใช้ 25
μ M CKS เปปไทด์ ( rrkhaaigpsaysita ) , CK1 เฉพาะสาร โมเลกุลแบบ 19

ลำดับสองถูกสร้างขึ้นด้วย
clustalx รุ่น 2.0.20 โมเลกุลเชื่อมต่อการคำนวณโดยนำทอง 5.2,21
ออกมาใช้กับ goldscore คะแนนการทำงานและ
มนุษย์ dyrk1a โปรตีนโครงสร้าง ( รหัส PDB 3anr22 ) ลำดับ
จัดตำแหน่งระหว่างหนู dyrk1a ( ใช้สำหรับโปรตีนไคเนส
assay ) และ dyrk1a มนุษย์ ( ใช้สำหรับโมเลกุล docking ) พบว่ามีเพียง 3
การกลายพันธุ์ระหว่างทั้งสองโปรตีนใน
ตำแหน่ง 32 , 404 , 543 ( รูปสามารถดูข้อมูลสนับสนุน ) .
กาก แต่ห่างไกลจากเว็บไซต์ผูกพัน ( มากกว่า 43 • ) และสองอื่น ๆต่อ
เป็นจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับไม่
อยู่ในโครงสร้างโปรตีนที่ใช้สำหรับการเชื่อมต่อ , implying ที่
docking ผลลัพธ์ที่สามารถเชื่อถือได้เมื่อเทียบกับโปรตีน kinase assay
ข้อมูล เว็บไซต์รวมถูกกำหนดเป็นทรงกลมที่มีรัศมีประมาณ 15 •
CB อะตอมของ " ยาม " phe238 กาก สามมิติ
พิกัดของลิแกนด์ได้ใช้ corina รุ่น 3.44
( http : / / www.molecular-networks . com / )ภาพที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้รุ่น
pymol 1.6 ( http : / / www.schrodinger . com / )