2. Material and methods2.1. MilkRaw

2. Material and methods
2.1. Milk
Raw whole milk was obtained from a pool of fresh milk from the herd of Danish Holstein cows at Aarhus University, Foulum (3.8% fat, 3.5% protein). To regulate LPL activity a combination of homogenisation, incubation and addition of FBS was used.

The activity of LPL was stopped by pasteurising in a water bath with shaking at 65 °C for 30 min (Table 1, treatment 1). To activate LPL, raw whole milk was incubated overnight at room temperature with shaking (Table 1, treatment 2) or added 10% foetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), which contains the LPL co-enzyme ApoCII (Egelrud & Olivecrona, 1973) before overnight incubation (Table 1, treatment 3). Other milk sample were homogenised by ultra-sonication before either pasteurisation (Table 1, treatment 4), incubated overnight at room temperature (Table 1, treatment 5) or added FBS before incubation (Table 1, treatment 6) to increase access of LPL to milk triglycerides. All milk samples were pasteurised after their respective treatments except treatment 1 and 4, which were pasteurised immediately after sampling. To inhibit growth of bacteria during incubation of milk at room temperature, 1% penicillin/streptomycin (P/S) (Sigma Aldrich, Brøndby, Denmark) was added to all samples. FBS contained 1 μm FFA.

Table 1.
Overview of the different treatments applied to the raw whole milk; all samples were pasteurised after their respective treatments.a
Treatment step Treatment ID#
C 1 2 3 4 5 6
Pasteurisation − + − − + − −
Incubation − − + + − + +
Addition of FBS − − − + − − +
Homogenisation − − − − + + +
a
The treatments of fresh whole milk were (as per treatment ID#): C (control), no treatment; 1, pasteurised; 2, incubated overnight at room temperature; 3, FBS added in final concentration of 10% before incubation; 4, homogenised; 5, homogenised then incubated overnight at room temperature; 6, supplemented with FBS to a final concentration of 10% before incubation. All milk samples, including the control, were pasteurised after the described treatments.

Table options
2.2. Ultrasonic homogenisation
Raw whole milk (70 mL) was heated to 40 °C in a water bath, followed by probe (Sonotrode S7, Hielscher, Berlin, Germany) homogenisation with stirring for 0.5 min, 2 min or 4 min. Particle size distributions were determined by integrated light scattering using a Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). A homogenisation time of 1 min was chosen for further experiments, as the mean fat globule size of the whole milk (0.75 μm) was similar to that of commercial whole milk (0.73 μm).

2.3. Cell culture
Human HTC 116 (American Type Culture Collection, CCL247) cells were cultured in 175 cm2 flasks (Thermo Scientific, Roskilde, Denmark) in 25 mL growth medium consisting of McCoy's 5A growth medium containing 10% FBS and 1% P/S.

Cells were seeded into 24 well plates (Thermo Scientific) at a density of 1 × 105 cells cm−2. The next day, wells were washed with PBS, and 500 μL cell culture medium was added. After 1 h incubation, an additional 500 μL cell culture medium containing the experimental sample were added.

A mixture of sodium salts of butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate, dodecanoate, myristate, palmitate, stearate, oleate and linoleate (all obtained from Sigma Aldrich), was conjugated to FA free bovine serum albumin (BSA, Sigma Aldrich) (FA:BSA ratio 1:5) by adding the FAs to heated (37 °C) BSA-enriched cell culture medium and homogenised for 15 s under stirring to aid conjugation. The mixture was left shaking (6 h) at 37 °C before being added to cells to a final concentration of 1.4 mm The concentration of the FFA solution was verified using the ECF-FFA method described in section 2.5 with results deviating less than 10% from the theoretical value.

The water soluble sodium salts of butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate or dodecanoate were dissolved individually in cell culture medium to a final concentration of 1.4 mm before being added to cells. BSA-conjugated sodium salts of butyrate, dodecanoate, palmitate or oleate were added individually to cells at a final concentration of 1.4 mm.

Cells were incubated at 37 °C for 6 h, washed three times in PBS and either lysed with 350 μL lysis buffer (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Copenhagen, Denmark) for quantitative PCR analysis, or 1 mL fresh cell culture medium was added for additionally 18 h to measure protein levels of ANGPTL4 by ELISA. Cell viability was determined by the WST-1 reagent (Roche, Hvidovre, Denmark) and it was verified that the viability of cells was not significantly affected by any of the tested samples.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. นมนมดิบที่ได้จากกลุ่มของนมสดจากฝูงวัวโฮลชไตน์ภาษาเดนมาร์กที่อาร์ฮุส Foulum (ไขมัน 3.8%, 3.5% โปรตีน) การควบคุมกิจกรรมเอส homogenisation คณะทันตแพทยศาสตร์ และนอกจากนี้ของ FBS ใช้กิจกรรมของเอสถูกหยุด โดย pasteurising ในห้องน้ำด้วยการสั่นที่ 65 ° C ใน 30 นาที (ตารางที่ 1 รักษา 1) การเปิดใช้งานเอส นมดิบถูก incubated ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้องด้วยการสั่น (ตาราง 1, 2 การรักษา) หรือเพิ่ม 10% foetal วัวซีรั่ม (FBS, Gibco คาร์ลส CA, USA), ซึ่งประกอบด้วยเอสร่วมเอนไซม์ ApoCII (Egelrud & Olivecrona, 1973) ก่อนค้างคืนบ่ม (ตาราง 1 รักษา 3) ตัวอย่างนมอื่น ๆ ถูก homogenised โดยอัลตร้า sonication ก่อน pasteurisation ใด (ตารางที่ 1 รักษา 4), incubated ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง (ตาราง 1 รักษา 5) ค่า FBS ก่อนบ่ม (ตาราง 1 รักษา 6) เพื่อเพิ่มการเข้าถึงของเอสนมระดับไตรกลีเซอไรด์ ตัวอย่างน้ำนมทั้งหมดถูก pasteurised หลังการรักษาตามลำดับยกเว้นรักษา 1 และ 4 ซึ่งถูก pasteurised ทันทีหลังจากสุ่มตัวอย่าง ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในระหว่างการบ่มของน้ำนมที่อุณหภูมิห้อง มีเพิ่ม 1% ยา เพนนิซิลลิน/streptomycin (P/S) (Aldrich ซิก Brøndby เดนมาร์ก) กับตัวอย่างทั้งหมด FBS อยู่ 1 μm FFAตารางที่ 1ภาพรวมของการรักษาแตกต่างกันที่ใช้ทั้งนมดิบ ตัวอย่างทั้งหมดถูก pasteurised หลังจาก treatments.a ของพวกเขาเกี่ยวข้องขั้นตอนการบำบัดรักษา ID #C 1 2 3 4 5 6Pasteurisation − + −− + −−คณะทันตแพทยศาสตร์−− ++ − ++นอกจากนี้ของ FBS −−− + −− +Homogenisation −−−− +++การรักษาของนมสดได้ (ตามรักษา ID #): C (ตัวควบคุม), ไม่รักษา 1, pasteurised 2, incubated ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง 3, FBS เพิ่มในความเข้มข้นสุดท้าย 10% ก่อนบ่ม 4, homogenised 5, homogenised แล้ว incubated ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง 6 เสริม ด้วย FBS จะเข้มข้นสุดท้าย 10% ก่อนที่จะฟักตัว ตัวอย่างน้ำนมทั้งหมด รวมถึงการควบคุม มี pasteurised หลังรักษาอธิบายตัวเลือกตาราง2.2 การ ultrasonic homogenisationนมดิบ (70 mL) ที่อุณหภูมิ 40 ° C ในน้ำน้ำ ตาม homogenisation โพรบ (Sonotrode S7, Hielscher เบอร์ลิน เยอรมนี) กับกวนสำหรับ 0.5 นาที 2 นาทีหรือ 4 นาทีกระจายขนาดอนุภาคถูกกำหนด โดยรวมแสง scattering ใช้ 2000 Mastersizer (มัลเวิร์น จำกัดเครื่องมือ มัลเวิร์น UK) เวลา homogenisation 1 นาทีถูกเลือกให้ทดลองเพิ่มเติม เป็นนมพาณิชย์ (0.73 μm) ขนาด globule หมายถึงไขมันของนม (0.75 μm)2.3. เซลล์วัฒนธรรมเซลล์ 116 HTC (คอลเลกชันชนิดวัฒนธรรมอเมริกัน CCL247) มนุษย์มีอ่างใน 175 cm2 นำ (วิทยาศาสตร์เทอร์โม Roskilde เดนมาร์ก) ใน 25 mL เชื้อประกอบด้วยของแท้ขนาดกลางเจริญเติบโตของ 5A ประกอบด้วย 10% FBS และ 1% P/s ได้เซลล์ถูก seeded เป็นดี 24 แผ่น (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) ที่ความหนาแน่นของ 1 × 105 เซลล์ cm−2 วัน บ่อถูกล้าง ด้วย PBS และเพิ่มสื่อวัฒนธรรมเซลล์ μL 500 มีเพิ่มการเติม 500 μL เซลล์วัฒนธรรมสื่อที่ประกอบด้วยตัวอย่างทดลองหลังจากฟักตัว 1 hส่วนผสมของเกลือโซเดียม butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate, dodecanoate, myristate, palmitate ส oleate และ linoleate (ทั้ง หมดได้จากซิก Aldrich), ถูกกลวงให้ FA ฟรีวัว serum albumin (บีเอสเอ ซิก Aldrich) (FA:BSA อัตราส่วน 1:5) โดยเพิ่ม Fa ที่ให้ความร้อน (37 ° C) ปานกลางวัฒนธรรมอุดมไปบีเอสเอเซลล์ และ homogenised 15 s ใต้กวนการ conjugation ช่วย ส่วนผสมที่เหลือเขย่า (6 h) ที่ 37 ° C ก่อนเพิ่มเซลล์เข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 mm ความเข้มข้นของการแก้ปัญหา FFA ถูกตรวจสอบโดยใช้วิธี ECF FFA ที่อธิบายไว้ในส่วน 2.5 ผล deviating น้อยกว่า 10% จากค่าทางทฤษฎีเกลือโซเดียมละลายน้ำ butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate หรือ dodecanoate ถูกละลายแยกในเซลล์วัฒนธรรมปานกลางถึงเข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 มม.ก่อนที่จะถูกเพิ่มไปยังเซลล์ เกลือโซเดียมที่บีเอสเอกลวง butyrate, dodecanoate, palmitate หรือ oleate ถูกเพิ่มเข้ามาแต่ละเซลล์ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 มม.เซลล์ถูก incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 6 h ล้างสามครั้งใน PBS และทั้ง lysed กับ 350 μL lysis บัฟเฟอร์ (RNeasy มินิชุด Qiagen โคเปนเฮเกน เดนมาร์ก) สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ PCR หรือสื่อวัฒนธรรมเซลล์สด 1 mL เพิ่มสำหรับวัดระดับโปรตีนของ ANGPTL4 นอกจากนี้ 18 h โดย ELISA เซลล์นี้ถูกกำหนด โดยรีเอเจนต์ WST 1 (Roche, Hvidovre เดนมาร์ก) และจะถูกตรวจสอบว่า ชีวิตของเซลล์ได้อย่างมีนัยสำคัญเช่นของตัวอย่างทดสอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 นม
นมดิบที่ได้รับจากสระว่ายน้ำของนมสดจากฝูงวัวเดนมาร์กไตน์ที่มหาวิทยาลัยอาร์ฮุส Foulum (ไขมัน 3.8% โปรตีน 3.5%) ในการควบคุมการทำงานรวมกันของ LPL homogenisation, บ่มและนอกเหนือจาก FBS ถูกนำมาใช้. กิจกรรมของ LPL หยุด pasteurising ในอ่างน้ำที่มีการสั่นสะเทือนที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที (ตารางที่ 1 การรักษา 1) เพื่อเปิดใช้งาน LPL, นมดิบถูกบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้องที่มีการสั่นสะเทือน (ตารางที่ 1 การรักษา 2) หรือเพิ่ม 10% ของทารกในครรภ์ในซีรั่มวัว (FBS, Gibco, คาร์ลส, CA, USA) ซึ่งมี LPL ร่วมเอนไซม์ ApoCII ( Egelrud & Olivecrona, 1973) ก่อนที่จะบ่มข้ามคืน (ตารางที่ 1 การรักษา 3) ตัวอย่างนมอื่น ๆ ที่ถูกปั่นโดยอัลตร้า sonication ก่อนทั้งพาสเจอร์ไรซ์ (ตารางที่ 1 การรักษา 4), บ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง (ตารางที่ 1 การรักษา 5) หรือเพิ่ม FBS ก่อนบ่ม (ตารางที่ 1 การรักษา 6) เพื่อเพิ่มการเข้าถึงของ LPL ไป ไตรกลีเซอไรด์นม ตัวอย่างนมพาสเจอร์ไรส์ทุกคนหลังจากการรักษาของตนยกเว้นการรักษาที่ 1 และ 4 ซึ่งได้รับการพาสเจอร์ไรส์ทันทีหลังจากการสุ่มตัวอย่าง ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในระหว่างการบ่มของนมที่อุณหภูมิห้อง penicillin% 1 / streptomycin (P / S) (Sigma ดิช, Brøndby, เดนมาร์ก) ถูกบันทึกอยู่ในทุกตัวอย่าง FBS มี 1 ไมโครเมตร FFA. ตารางที่ 1. ภาพรวมของการรักษาที่แตกต่างกันนำไปใช้กับทั้งนมดิบ ตัวอย่างทั้งหมดถูกพาสเจอร์ไรส์หลังจาก treatments.a ของตนขั้นตอนการบำบัดรักษา ID # C 1 2 3 4 5 6 พาสเจอร์ไรซ์ - + - - + - - บ่มเพาะ - - + - + + เพิ่มของ FBS - - - + - - + homogenisation - - - - + + ทรีทเม้นของนมสดทั้งเป็น (ตามการรักษา # ID): C (ควบคุม) ไม่มีการรักษา; 1, พาสเจอร์ไรส์; 2 บ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง; 3, FBS เพิ่มเข้ามาในความเข้มข้นสุดท้ายของ 10% ก่อนที่จะบ่ม; 4, ปั่น; 5, ปั่นบ่มแล้วค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง; 6, เสริมด้วย FBS ที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 10% ก่อนที่จะบ่มเพาะ ทั้งหมดตัวอย่างนมรวมถึงการควบคุมที่ถูกพาสเจอร์ไรส์หลังจากการรักษาอธิบาย. ตัวเลือกตารางที่2.2 homogenisation อัลตราโซนิกนมดิบ (70 มิลลิลิตร) ที่ถูกความร้อนถึง 40 ° C ในอ่างน้ำตามด้วยการสอบสวน (Sonotrode S7, Hielscher, เบอร์ลิน, เยอรมนี) homogenisation กับกวนเวลา 0.5 นาที, 2 นาทีหรือ 4 นาที การกระจายขนาดของอนุภาคที่ถูกกำหนดโดยการกระเจิงแสงแบบบูรณาการโดยใช้ Mastersizer 2000 (เวิร์นเครื่องดนตรี จำกัด เวิร์สหราชอาณาจักร) เวลา homogenisation 1 นาทีเป็นทางเลือกสำหรับการทดลองต่อไปในขณะที่ขนาดเม็ดไขมันเฉลี่ยของนมทั้ง (0.75 ไมครอน) ได้รับการคล้ายกับที่ของนมทั้งในเชิงพาณิชย์ (0.73 ไมครอน). 2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์มนุษย์ HTC 116 (อเมริกันประเภทวัฒนธรรมสะสม CCL247) เซลล์เพาะเลี้ยงในขวด 175 cm2 (เทอร์โมวิทยาศาสตร์, กิลด์, เดนมาร์ก) ใน 25 มลสื่อการเจริญเติบโตประกอบด้วยสื่อการเจริญเติบโต 5A ของแท้ที่มี 10% FBS และ 1% P / S เซลล์ที่ถูกเมล็ดเป็น 24 แผ่นดี (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) ที่ระดับความหนาแน่น 1 × 105 เซลล์เซนติเมตร-2 วันรุ่งหลุมถูกล้างด้วยพีบีเอสและ 500 ไมโครลิตรกลางการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากบ่ม 1 ชั่วโมงเพิ่มอีก 500 ไมโครลิตรอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีตัวอย่างทดลองถูกเพิ่ม. ส่วนผสมของเกลือโซเดียมของ butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate, dodecanoate, myristate, palmitate, stearate, oleate และ linoleate (ทั้งหมดที่ได้รับจาก Sigma Aldrich ) ถูกผันไปยังเอฟเอฟรีอัลบูมิซีรั่มวัว (BSA ซิกดิช) (เอฟเอ: BSA อัตราส่วน 1: 5) โดยการเพิ่ม FAs จะร้อน (37 ° C) เซลล์บีเอสเอที่อุดมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อและเข้ากันเป็นเวลา 15 ภายใต้การกวน ผันช่วยเหลือ ส่วนผสมถูกทิ้งสั่น (6 ชั่วโมง) ที่อุณหภูมิ 37 ° C ก่อนที่จะถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 มมความเข้มข้นของการแก้ปัญหา FFA ถูกตรวจสอบโดยใช้วิธี ECF-FFA อธิบายไว้ในส่วน 2.5 ที่มีผลการเบี่ยงเบนน้อยกว่า 10% จากมูลค่าทางทฤษฎี. เกลือโซเดียมที่ละลายน้ำได้ของ butyrate, hexanoate, octanoate, decanoate หรือ dodecanoate กำลังละลายบุคคลในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 มมก่อนที่จะถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ เกลือโซเดียม BSA-ผันของ butyrate, dodecanoate, palmitate หรือ oleate ถูกเพิ่มเป็นรายบุคคลไปยังเซลล์ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.4 มม. เซลล์ที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 ชั่วโมงล้างสามครั้งในพีบีเอสและทั้ง lysed 350 ไมโครลิตร lysis บัฟเฟอร์ (RNeasy มินิชุด Qiagen, โคเปนเฮเกน, เดนมาร์ก) สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ PCR หรือ 1 มิลลิลิตรกลางการเพาะเลี้ยงเซลล์สดที่ถูกเพิ่มเข้ามาสำหรับ 18 ชั่วโมงนอกจากนี้ในการวัดระดับของโปรตีน ANGPTL4 โดยวิธี ELISA มีชีวิตเซลล์ถูกกำหนดโดยน้ำยา WST-1 (โรช Hvidovre, เดนมาร์ก) และได้รับการตรวจสอบแล้วว่ามีศักยภาพของเซลล์ที่ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญโดยใด ๆ ของตัวอย่างทดสอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . นมดิบ นมสด
ได้จากสระว่ายน้ำของนมสดจากฝูงวัวโฮลชไตน์เดนมาร์กที่มหาวิทยาลัย Aarhus foulum ( 3.8 % โปรตีนไขมัน 3.5% ) เพื่อควบคุมกิจกรรม lpl การโฮโมจีไนเซชั่นและบ่มเพาะ , นอกเหนือจาก FBS ได้ใช้

กิจกรรมของ lpl ถูกหยุดโดย pasteurising ในอ่างน้ำ เขย่า ที่ 65 องศา C นาน 30 นาที ( ตารางที่ 1การรักษา ( 1 ) เพื่อเปิดใช้งาน lpl ดิบ นมสดถูกบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้องกับสั่น ( ตารางที่ 1 การรักษา 2 ) หรือเพิ่ม 10% เซรั่มวัว foetal ( FBS gibco Carlsbad , CA , USA ) ซึ่งมี lpl โคเอนไซม์ apocii ( egelrud &โอลิฟโครนา , 1973 ) ก่อนคืนบ่ม ( ตารางที่ 1 การรักษา 3 )ตัวอย่างนมอื่น ๆ homogenised อัลตร้า sonication ก่อนที่ทั้งปา ตอไรเซชั่น ( ตารางที่ 1 การรักษา 4 ) บ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง ( ตารางที่ 1 การรักษา 5 ) หรือเพิ่ม FBS ก่อนการบ่ม ( ตารางที่ 1 การรักษา 6 ) เพื่อเพิ่มการเข้าถึงของ lpl นมไตรกลีเซอไรด์ . ตัวอย่างนมทั้งหมดหลังจากการรักษาของตน ยกเว้นการพาสเจอร์ไรซ์ 1 และ 4ซึ่งพาสเจอร์ไรซ์ทันทีหลังจากคน ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ในน้ำนมบ่มที่อุณหภูมิห้อง 1 % เพนนิซิลลิน / ยาสเตรปโตมัยซิน ( P / S ) ( ซิกม่า Aldrich br ขึ้น ndby , เดนมาร์ก ) คือเพิ่มทุกตัวอย่าง FBS มี FFA M 1 μ


โต๊ะ 1 . ภาพรวมของการรักษาที่แตกต่างกันไปทั้งนมดิบ ; ตัวอย่างพาสเจอร์ไรซ์ หลังจากที่ตน
บําบัดการรักษาขั้นตอนการรักษา ID #
c 1 2 3 4 5 6
ปา ตอไรเซชั่น−−−−−−−− 1

1 −−−−− FBS
โฮโมจีไนเซชั่น−−−−
A
รักษานมสด ( ตามการรักษา ID # ) : C ( ควบคุม ) , ไม่ รักษา ; 1 , พาสเจอร์ไรซ์ 2 บ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง 3 FBS เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 10% ก่อนการบ่ม ; 4homogenised ; 5 , homogenised แล้วบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง 6 เสริมด้วย FBS ครั้งสุดท้าย ความเข้มข้น 10 % ก่อนการบ่ม ตัวอย่างนมทั้งหมดรวมทั้งควบคุม , พาสเจอร์ไรซ์ หลังจากอธิบายการรักษา


ตัวเลือกตาราง 2.2 . เครื่องโฮโมจีไนเซชั่น
ดิบนมทั้งหมด ( 70 มล. ) ก็ร้อนถึง 40 องศา C ในการอาบน้ำ ตามด้วยโพรบ ( sonotrode S7 hielscher , , เบอร์ลินเยอรมนี ) โฮโมจีไนเซชั่นกับกวน 0.5 นาที 2 นาที หรือ 3 นาทีขนาดอนุภาคกระจายถูกกำหนดโดยรวม การกระจายแสงใช้ mastersizer 2000 ( Malvern เครื่องมือจำกัด , Malvern , สหราชอาณาจักร ) เป็นโฮโมจีไนเซชั่น เวลา 1 นาทีถูกเลือกสำหรับการทดลองต่อไป , เป็นเม็ดกลมเล็กขนาดว่าไขมันของนมทั้งหมด ( 0.75 μ M ) คล้ายกับที่ของการค้าทั้งนม ( 0.73 μ M )

2.3การเพาะเลี้ยงเซลล์มนุษย์
HTC 116 ( ประเภทคอลเลกชัน วัฒนธรรมอเมริกัน ccl247 ) เซลล์เพาะเลี้ยงในขวด 175 ตร. ซม. ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Roskilde , เดนมาร์ก ) ใน 25 มล. การเจริญเติบโตปานกลางประกอบด้วยของแท้เป็น 5A growth medium ที่มี FBS 10% และ 1% P / S .

เซลล์ถูก seeded 24 ดีแผ่น ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) ที่ความหนาแน่น 1 × 105 เซลล์ cm − 2 วันต่อมา คือ ล้างบ่อพีบีเอสและ 500 μ L เซลล์วัฒนธรรมอาหารเพิ่ม หลังจาก 1 ชั่วโมง บ่มเพาะ เพิ่ม 500 μ L เซลล์วัฒนธรรมอาหารที่มีตัวอย่างทดลองเพิ่ม

มีส่วนผสมของเกลือโซเดียมของบิว hexanoate octanoate เอท , , , , dodecanoate 30 องศาเซลเรต , ที่สุด , , โอลีเอทและลิโนลีเ ( ทั้งหมดที่ได้รับจากซิกม่า Aldrich ) , และอัลบูมิน ( ฟ้าฟรี บีเอสเอซิกม่า Aldrich ( ฟ้า ) : BSA อัตราส่วน 1 : 5 ) โดยการเพิ่มอย่างรวดเร็วเพื่อให้ความร้อน ( 37 ° C ( เซลล์ ) อุดมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อและ homogenised 15 s ภายใต้กวนเพื่อช่วยในการ ส่วนผสมที่เหลือสั่น ( 6 ชั่วโมง ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C ก่อนที่จะถูกเพิ่มไปยังเซลล์มีความเข้มข้นสุดท้าย 1.4 มิลลิเมตร ความเข้มข้นของสารละลายที่ใช้ ecf-ffa FFA ตรวจสอบวิธีการที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 25 กับผลลัพธ์ที่กะล่อนน้อยกว่า 10 % จากมูลค่าทางทฤษฎี

น้ำละลายเกลือโซเดียมของบิว hexanoate octanoate , , , dodecanoate เอท หรือละลายจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ ) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1.4 มิลลิเมตร ก่อนที่จะถูกเพิ่มไปยังเซลล์ BSA และเกลือโซเดียมของบิว dodecanoate , ,ที่สุดหรือโอลีเอทเพิ่มบุคคลไปยังเซลล์ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1.4 mm .

เซลล์ถูกบ่มที่ 37 ° C 6 H , ล้างสามครั้งใน PBS และทั้ง lysed กับ 350 μ l การสลายบัฟเฟอร์ ( rneasy Mini Kit , เพิ่ม , โคเปนเฮเกน , เดนมาร์ก ) สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ PCR หรือ 1 ml ใหม่วัฒนธรรม เซลล์ปานกลางเพิ่มนอกจากนี้ 18 H เพื่อวัดระดับโปรตีนของ angptl4 โดยวิธีอีไลซ่าเซลล์ถูกกำหนดโดยรีเอเจนต์ wst-1 ( โรเช่ , Hvidovre , เดนมาร์ก ) และมันก็ยืนยันว่าไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์โดยใด ๆของการทดสอบตัวอย่าง