PCR, 454 sequencing and data proces

PCR, 454 sequencing and data processing
If not otherwise mentioned, all the steps were performed according to the Roche 454 sequencing protocol for ampli- cons. To generate the amplicon library for bacteria and archaea, specific primers were selected according to two criteria: (a) the fragment should span 600 bases of the 16S rRNA gene to receive sufficient phylogenetic information and (b) the primers should bind to as many bacterial/archae- al sequences as possible without detecting non-target groups. To verify these criteria, the ARB probe match tool was used with the latest SILVA database (containing over 400,000 sequences), resulting in the following bacterial 16S primers: 926-F (5′-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3′, Escherichia coli position 907–926 (Lane 1991)) and 630- R (5 ′-CAKAAAGGAGGTGATCC-3′, E. coli position 1528–1544 (Juretschko et al. 1998)). The archaeal primers were rSAf(i) (5′-CCTAYGGGGCGCAGCAG-3′, E. coli position 341–357 (Nicol et al. 2003)) and 958r (5′- YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′, E. coli position 940– 958 (Bano et al. 2004)). These primers were extended as amplicon fusion primers with respective A and B adapters, key sequence and multiplex identifiers (MID) as recommen- ded and tested in initial PCR reactions to determine their optimal annealing temperatures (50°C, 54°C, 58°C), cycle numbers (20, 22, 25, 30) and amounts of template DNA (50, 100, 200 ng). The conditions under which a sufficient amount (approximately 1012 molecules) of specific ampli- cons of the right size was generated using the lowest number of cycles in all the samples were determined (50°C, 22 cycles, 50 ng) for bacterial 16S rRNA genes. For archae- al 16S rRNA genes, 30 cycles and the addition of 8% DMSO were necessary to obtain sufficient PCR product for archaea. These conditions were then used to produce four amplicon libraries each (top and middle/bottom part of the high- and low-current-producing PMFC). The PCR products were purified with AMPure Beads (Agencourt, Beckman Coulter, Krefeld, Germany) and pooled in equi- molar amounts.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR, 454 จัดลำดับและประมวลผลข้อมูลถ้าไม่ กล่าวถึง ทุกขั้นตอนดำเนินการตามโพรโทคอลลำดับ Roche 454 สำหรับ ampli เด็ก เพื่อสร้างไลบรารี amplicon สำหรับแบคทีเรียและอาร์เคีย เลือกไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงตามเกณฑ์ที่สอง: ส่วน (ก)ควรขยายฐาน 600 ของยีนใน rRNA 16S เพื่อรับข้อมูลทางที่เพียงพอ และไพรเมอร์ (ข)ลำดับ แบคทีเรีย/archae-al มากควรผูกเป็นไป โดยไม่มีกลุ่มเป้าหมายไม่ใช่การตรวจจับ การตรวจสอบเงื่อนไขเหล่านี้ ใช้ ARB รบตรงมือกับล่าสุด SILVA ฐานข้อมูล (ประกอบด้วยลำดับมากกว่า 400,000), เกิดในไพรเมอร์ 16S แบคทีเรียที่ต่อไปนี้: 926-F (5 ′-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3′, Escherichia coli ตำแหน่ง 907-926 (1991 เลน)) และ 630-R (5 ทั้ง-CAKAAAGGAGGTGATCC-3′, E. coli ตำแหน่ง 1528 – 1544 (Juretschko et al. 1998)) ไพรเมอร์ archaeal ได้ rSAf(i) (5 ′-CCTAYGGGGCGCAGCAG-3′, E. coli ตำแหน่ง 341 – 357 (หำ et al. 2003)) และ 958r (ตำแหน่ง 5 ′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′, E. coli 940– 958 (Bano et al. 2004)) ไพรเมอร์เหล่านี้ออกเป็นไพรเมอร์ฟิวชั่น amplicon ตามลำดับ A B อะแดปเตอร์ ลำดับสำคัญ และรหัสมัลติเพล็กซ์ (MID) เป็น recommen ded และทดสอบในปฏิกิริยา PCR เริ่มต้นกำหนดรอบอุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุด (50° C, 54° C, 58° C), ตัวเลข (20, 22, 25, 30) และจำนวนของแม่แบบดีเอ็นเอ (50, 100, 200 ฉบับ) กำหนดเงื่อนไขภายใต้ซึ่งจำนวนที่เพียงพอ (ประมาณ 1012 โมเลกุล) ข้อเสีย ampli เฉพาะของขนาดเหมาะสมสร้างใช้จำนวนรอบต่ำสุดในกลุ่มตัวอย่าง (50° C รอบ 22, 50 ฉบับ) สำหรับแบคทีเรีย 16S rRNA ยีน สำหรับอัล archae 16S rRNA ยีน 30 รอบและเพิ่ม 8% DMSO มีความจำเป็นเพื่อขอรับผลิตภัณฑ์ PCR ที่เพียงพอสำหรับอาร์เคีย เงื่อนไขเหล่านี้แล้วใช้ในการผลิตสี่ amplicon ไลบรารีแต่ละ (ด้านบนและด้านกลางส่วนหนึ่งของความสูง และต่ำปัจจุบันผลิต PMFC) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์กับลูกปัด AMPure (Agencourt, Beckman Coulter, Krefeld เยอรมนี) และพูจำนวน equi-กราม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR, 454 และลำดับการประมวลผลข้อมูล
หากไม่ได้กล่าวถึงมิฉะนั้นขั้นตอนทั้งหมดที่ได้ดำเนินการไปตาม Roche 454 โปรโตคอลลำดับสำหรับข้อเสียตะแกรง เพื่อสร้างห้องสมุด amplicon สำหรับเชื้อแบคทีเรียและเคียไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงได้รับการคัดเลือกตามเกณฑ์สอง (ก) ชิ้นส่วนควรครอบคลุม 600 ฐานของยีน 16S rRNA จะได้รับข้อมูล phylogenetic เพียงพอและ (ข) ไพรเมอร์ควรผูกกับเป็นจำนวนมากแบคทีเรีย / archae- อัลลำดับที่เป็นไปได้โดยไม่ต้องมีการตรวจสอบกลุ่มไม่ใช่เป้าหมาย เพื่อตรวจสอบเกณฑ์เหล่านี้เครื่องมือ ARB สอบสวนการแข่งขันถูกนำมาใช้กับฐานข้อมูล SILVA ล่าสุด (ที่มีมากกว่า 400,000 ลำดับ) ส่งผลให้แบคทีเรีย 16S ไพรเมอร์ต่อไปนี้: 926-F (5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3 ', Escherichia coli ตำแหน่ง 907-926 (ถนน 1991)) และ 630- R (5 '-CAKAAAGGAGGTGATCC-3' อีโคไลตำแหน่ง 1528-1544 (Juretschko et al. 1998)) ไพรเมอร์ archaeal เป็น RSAF (I) (5'-CCTAYGGGGCGCAGCAG-3 'อีโคไลตำแหน่ง 341-357 (โรล et al. 2003)) และ 958r (5'- YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3' อีโคไลตำแหน่ง 940- 958 (มูรัต et al. 2004)) ไพรเมอร์เหล่านี้ถูกขยายเป็นไพรเมอร์ amplicon ฟิวชั่นที่เกี่ยวข้องกับ A และอะแดปเตอร์ B, ลำดับที่สำคัญและตัวบ่งชี้ multiplex (MID) รวมเด็ด recommen- และทดสอบในปฏิกิริยา PCR เริ่มต้นในการกำหนดอุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุดของพวกเขา (50 ° C 54 ° C, 58 ° C), ตัวเลขวงจร (20, 22, 25, 30) และปริมาณของดีเอ็นเอแม่แบบ (50, 100, 200 NG) ภายใต้เงื่อนไขที่ปริมาณที่เพียงพอ (ประมาณ 1012 โมเลกุล) ของข้อเสียตะแกรงที่เฉพาะเจาะจงของขนาดที่เหมาะสมที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้จำนวนต่ำสุดของรอบในตัวอย่างทั้งหมดที่ได้รับการพิจารณา (50 ° C, 22 รอบ 50 NG) สำหรับแบคทีเรีย 16S rRNA ยีน สำหรับ archae- ยีนอัล 16S rRNA 30 รอบและนอกเหนือจาก 8% DMSO มีความจำเป็นอย่างเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ PCR เพียงพอสำหรับเคีย เงื่อนไขเหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการผลิตแล้วสี่ amplicon ห้องสมุดแต่ละ (บนและกลาง / ล่างเป็นส่วนหนึ่งของสูงและต่ำในปัจจุบันการผลิต PMFC) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์กับ AMPure ลูกปัด (Agencourt, Beckman Coulter, เครเฟลด์เยอรมนี) และสำรองในปริมาณกราม equi-

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

PCR , 454 ลำดับการประมวลผลถ้าไม่เช่นนั้นกล่าวถึงขั้นตอนทั้งหมดมีการปฏิบัติตามเพื่อรอช 454 ลำดับพิธีสารเพื่อ ampli - ข้อเสีย เพื่อสร้างห้องสมุดและสำหรับแบคทีเรียและอาร์เคีย , ไพรเมอร์จำเพาะ ซึ่งตามสองเกณฑ์ : ( ) ส่วนควรช่วง 600 ฐานของยีน 16S rRNA เพื่อรับข้อมูล ซึ่งเพียงพอ และ ( ข ) โดยมัดมากแบคทีเรีย / archae - อัลลำดับเป็นไปได้โดยไม่มีการตรวจสอบไม่ใช่กลุ่มเป้าหมาย เพื่อตรวจสอบเงื่อนไขเหล่านี้ , ARB ตรวจสอบราคาใช้เครื่องมือล่าสุดกับ ซิลวา ฐานข้อมูล ( ที่มีมากกว่า 400000 ลำดับ ) ส่งผลต่อแบคทีเรียใช้ไพรเมอร์ : 926-f ( 5 ’ - ’ aaactyaaakgaattgacgg-3 , Escherichia coli ตำแหน่ง 862 – 926 ( เลน 1991 ) และ 630 - R ( 5 ’ - ’ cakaaaggaggtgatcc-3 , E . coli ตำแหน่ง 1528 – 1599 ( juretschko et al . 1998 ) ไพรเมอร์ archaeal เป็น rsaf ( ฉัน ) ( 5 ’ - ’ cctayggggcgcagcag-3 , E . coli ตำแหน่ง 341 – 357 ( นิโคล et al . 2546 ) และ 958r ( 5 ’ - ’ yccggcgttgamtccaatt-3 , E . coli ตำแหน่ง 940 – 958 ( bano et al . 2004 ) ) ไพรเมอร์เหล่านี้ขยายเป็นไพรเมอร์และฟิวชั่นกับเกี่ยวข้อง A และ B อะแดปเตอร์ , ลําดับและระบบมัลติเพล็กซ์ ระบุ คีย์ ( กลาง ) เป็น recommen - เด็ด และทดสอบในปฏิกิริยา PCR เบื้องต้นเพื่อตรวจสอบของพวกเขาที่เหมาะสมอุณหภูมิอบ ( 50 ° C , 54 ° C , 58 องศา C ) , ตัวเลขรอบ ( 20 , 22 , 25 , 30 ) และปริมาณดีเอ็นเอแม่แบบ ( 50 , 100 , 200 นาโน ) ภายใต้เงื่อนไขที่เพียงพอ ( ประมาณขนาดของโมเลกุล ) ของ ampli - เฉพาะข้อเสียของขนาดที่เหมาะสมถูกสร้างขึ้น โดยใช้ค่าจำนวนรอบในตัวอย่างทั้งหมดถูกกำหนด ( 50 ° C 22 รอบ 50 นาโนกรัม ) สำหรับแบคทีเรีย 16S rRNA ยีน สำหรับ archae - อัลเบส 16S rRNA ยีน 30 รอบ และเพิ่มเป็นร้อยละ 8 DMSO จำเป็นต้องได้รับผลิตภัณฑ์ PCR ที่เพียงพอสำหรับอาร์เคีย . เงื่อนไขเหล่านี้ถูกใช้เพื่อผลิตสี่และห้องสมุดแต่ละ ( ด้านบนและด้านล่างส่วนกลาง / สูง - ต่ำและในปัจจุบันการผลิต pmfc ) ที่เพิ่มปริมาณให้บริสุทธิ์ด้วยลูกปัด ( agencourt Beckman Coulter , เขตอำเภอเมือง , pooled ใน Krefeld เยอรมนี ) และฟันกรามในปริมาณที่เท่ากัน .