1. IntroductionThe genus Trichoderm

1. Introduction
The genus Trichoderma belongs to ascomycetic fungi found in the soil ( Samuels, 2006). Trichoderma spp. are well-known biocontrol agents against phytopathogens ( Romão-Dumaresq et al., 2012). For example, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens and Trichoderma viride are currently marketed as biocontrol agents. The mechanisms for anti-phytopathogen activities include antibiosis, mycoparasitism, induced resistance and niche exclusion ( Bae, 2011). Antibiosis involves the production of various antimicrobial compounds that function as inhibitors of phytopathogen growth (Vinale et al., 2008). More than 100 antimicrobial compounds have been identified from Trichoderma spp. ( Vinale et al., 2008). During the mycoparasitism process, phytopathogen cell walls are degraded by cell wall-degrading enzymes produced from Trichoderma ( Reithner et al., 2011). There is competition between Trichoderma spp. and phytopathogens for infection sites and nutrients, which is known as niche exclusion.

The genus Phytophthora is a devastating plant pathogen that infects almost all plant species ( Hansen et al., 2011). In 1861, deBary identified Phytophthora infestans as the causal agent of late potato blight, which was responsible for the Irish potato famine ( Raffaele et al., 2010). Phytophthora species are oomycetes, which are fungi-like eukaryotic microorganisms also known as water molds. More than 100 species of Phytophthora are potential plant pathogens. Phytophthora mycelia contain non-partitioned hyphae with several diploid nuclei. While chitin is the primary component of fungal cell walls, β-glucan and cellulose are the major components of Phytophthora cell walls. Phytophthora species produce different types of spores (oospores, chlamydospores and zoospores), but cannot synthesize sterols, which are the target of many fungicides ( Gaulin et al., 2010). As a result, Phytophthora pathogens are difficult to control using the majority of currently available fungicides. In addition, Phytophthora species can overcome chemical control agents and resistance to plant hosts via genetic flexibility.

In this study, the possibility for use of Trichoderma metabolites as biocontrol agents against Phytophthora was investigated. A total of 128 Trichoderma isolates were screened for their anti-Phytophthora activities using ethyl acetate extracts isolated from liquid cultures. Further confirmation of eight selected Trichoderma isolates was conducted by minimum inhibitory concentration, disk diffusion and antibiosis tests. In addition, we investigated the molecular and biochemical responses of Phytophthora and plants (pepper and tomato) after application of the ethyl acetate extract of KACC 40557.

2. Materials and methods
2.1. Trichoderma and Phytophthora isolates

A total of 128 Trichoderma isolates were obtained from the Rural Development Administration (RDA) Genebank Information Center (GIC) (Suwon, Republic of Korea) (data not shown). Trichoderma isolates were grown on potato dextrose agar (PDA) (Difco, Sparks, MD, USA) at 25 °C for 14 days under dark conditions. Seven Phytophthora isolates were maintained on 20% clarified V8 (cV8) juice agar (20% V8 juice, 8% CaCO3, 1.5% Bacto agar). The following seven species were used in this study: Phytophthora cactorum (KACC, Korea Agricultural Culture Collection, 40166), Phytophthora capsici (KACC 40157), Phytophthora drechsleri (KACC 40463), Phytophthora infestans (KACC 43071), Phytophthora melonis (KACC 40197), Phytophthora nicotianae (KACC 44717), and Phytophthora sojae (KACC 40412). These isolates were grown at the following temperatures to optimize their growth: P. infestans, 18 °C; P. cactorum and P. sojae, 25 °C; P. capsici, P. drechsleri, P. melonis and P. nicotianae, 30 °C. The isolates were cultivated for 5–13 days under dark conditions.

2.2. Extraction of Trichoderma metabolites using ethyl acetate

After 14-days of growth, sterile water (8 mL) was poured into the plates, and mycelia were harvested by scratching using a glass stick. The amount of harvested mycelia was dependent on isolates; however, the same concentration of extracts was used for the treatment. The harvested mycelia were poured into 500 mL of minimal salts broth (MIN) media in 1000 mL Erlenmeyer flasks and grown for 14 days at 25 °C at 150 rpm (Bae et al., 2011). Half of the volume of ethyl acetate (EtOAc, 250 mL) was added into the liquid culture and shaken at 150 rpm for 10 min. After 1 h of incubation without shaking, the top layer was transferred into a flask, concentrated, and dried using a rotary vacuum evaporator at 36 °C (Rouini et al., 2006). The dried extracts were weighed and dissolved in acetone–water (1:9, v/v).

2.3. Preliminary screening for anti-Phytophthora assay

The EtOAc extracts from 128 Trichoderma isolates were screened for anti-Phytophthora activity. Phytophthora plugs (0.6 cm diameter) were cut from actively growing edges of cV8 plates using a sterile cork borer and then placed

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทนำสกุล Trichoderma เป็นเชื้อรา ascomycetic ที่พบในดิน (Samuels, 2006) เชื้อเป็น biocontrol รู้จักแทนกับ phytopathogens (Romão-Dumaresq et al. 2012) เช่น Trichoderma harzianum, Trichoderma virens และ Trichoderma viride อยู่ในขณะนี้ตลาดเป็น biocontrol ตัวแทน กลไกสำหรับป้องกัน phytopathogen กิจกรรมรวม antibiosis, mycoparasitism เกิดความต้านทานและช่องแยก (แบ้ 2011) Antibiosis เกี่ยวข้องกับการผลิตสารต้านจุลชีพต่าง ๆ ที่ทำงานเป็นสารยับยั้งการเจริญเติบโต phytopathogen (Vinale et al. 2008) สารต้านจุลชีพมากกว่า 100 ได้รับการระบุจากเชื้อ (Vinale et al. 2008) ในระหว่างกระบวนการ mycoparasitism, phytopathogen ผนังเซลล์จะสลาย โดยเอนไซม์ย่อยสลายผนังเซลล์ผลิตจาก Trichoderma (Reithner et al. 2011) มีการแข่งขันระหว่างเชื้อและ phytopathogens สำหรับไซต์ที่ติดเชื้อและสารอาหาร ซึ่งเป็นที่รู้จักกันยกเว้นเฉพาะประเภทไฟเป็นเชื้อโรคพืชทำลายล้างที่ติดสายพันธุ์พืชเกือบทั้งหมด (แฮนเซน et al. 2011) ในปี 1861, deBary ระบุว่าไฟทอฟธอราเป็นตัวแทนเชิงสาเหตุของไหม้มันฝรั่งปลาย ซึ่งรับผิดชอบอดอยากมันฝรั่ง (Raffaele et al. 2010) ไฟชนิดมี oomycetes ซึ่งเป็นเชื้อราเหมือน eukaryotic จุลินทรีย์เรียกว่าแม่น้ำ กว่า 100 สายพันธุ์ของไฟเป็นเชื้อโรคพืชที่มีศักยภาพ Mycelia ไฟประกอบด้วยไม่ใช่แบ่ง hyphae กับแอลฟาพฤติกรรมมักหลาย ในขณะที่ไคทินเป็นส่วนประกอบหลักของผนังเซลล์เชื้อรา β-กลูแคนและเซลลูโลสเป็นส่วนประกอบสำคัญของผนังเซลล์ไฟ ไฟชนิดผลิตชนิดของรา (oospores, chlamydospores และ zoospores), แต่ไม่สามารถสังเคราะห์สเตอรอลส์ ซึ่งเป็นเป้าหมายของเชื้อรามาก (Gaulin et al. 2010) เป็นผล เชื้อไฟได้ยากส่วนใหญ่เชื้อราที่มีการใช้การควบคุม นอกจากนี้ ไฟสายพันธุ์สามารถเอาชนะแทนสารเคมีและความต้านทานการโฮสต์ผ่านยืดหยุ่นทางพันธุกรรมของพืชในการศึกษานี้ ความเป็นไปได้สำหรับการใช้สาร Trichoderma เป็น biocontrol ตัวแทนกับไฟถูกตรวจสอบ จำนวน 128 Trichoderma แยกถูกคัดกรองการใช้สารสกัดเอทิลอะซิเตทที่แยกจากของเหลววัฒนธรรมกิจกรรมป้องกันไฟ ดำเนินการยืนยันการแยก Trichoderma เลือกแปด โดยความเข้มข้น inhibitory ขั้นต่ำ ดิสก์ทดสอบการแพร่และ antibiosis นอกจากนี้ เราทำการตรวจสอบการตอบสนองทางชีวเคมี และโมเลกุลของไฟ และพืช (พริกและมะเขือเทศ) หลังจากการประยุกต์ททิลอะซีแยกของ KACC 405572. วัสดุและวิธีการ2.1. Trichoderma และไฟแยกจำนวน 128 Trichoderma แยกได้รับมาจากการบริหารงานพัฒนาชนบท (RDA) Genebank ข้อมูลศูนย์ (ทัน) (ซูวอน เกาหลี) (ไม่แสดงข้อมูล) แยก Trichoderma ที่ปลูกบนมันฝรั่งเป็นอาหาร (PDA) (Difco ประกายไฟ MD สหรัฐอเมริกา) ที่ 25 ° C 14 วันภายใต้เงื่อนไขที่มืด แยกไฟ 7 ยังคงไว้บน 20% ชี้แจง V8 (cV8) อาหารน้ำผลไม้ (ผลไม้ 20% V8, 8% CaCO3 อาหาร Bacto 1.5%) ต่อไปนี้เจ็ดสายพันธุ์ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้: ไฟ cactorum (KACC เกาหลีเกษตรลเล็ก 40166), ไฟ capsici (KACC 40157), ไฟ drechsleri (KACC 40463), ไฟทอฟธอรา (KACC 43071), ไฟ melonis (KACC 40197), ไฟ nicotianae (KACC 44717), และไฟ sojae (KACC 40412) แยกเหล่านี้ที่ปลูกที่อุณหภูมิต่อไปนี้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโต: P. ทอฟธอรา 18 ° C P. cactorum และ P. sojae, 25 ° C P. capsici, P. drechsleri, P. melonis และ P. nicotianae, 30 องศาเซลเซียส แยกได้ปลูก 5 – 13 วันภายใต้เงื่อนไขที่มืด2.2. การสกัดสาร Trichoderma ใช้เอทิลอะซิเตทหลังจาก 14 วันของการเติบโต น้ำหมัน (8 mL) ถูกเทลงในจาน และ mycelia ถูกเก็บเกี่ยวโดยใช้ไม้แก้ว จำนวน mycelia หวงถูกพึ่งแยก อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของสารสกัดเดียวกันที่ใช้สำหรับการรักษา Mycelia หวงถูกเทลงในเกลือน้อยสื่อซุป (นาที) ในขวด Erlenmeyer 1000 มล. 500 มล. และปลูก 14 วันที่อุณหภูมิ 25 ° C ที่ 150 rpm (แบ้ et al. 2011) ครึ่งหนึ่งของปริมาตรของเอทิลอะซิเตท (EtOAc, 250 มล.) ถูกเพิ่มเข้าไปในวัฒนธรรมของเหลว และเขย่าที่ 150 rpm 10 นาที หลังจาก 1 ชั่วโมงของการกกไข่โดยไม่ต้องสั่น ชั้นบนถูกโอนไปเป็นกระติกน้ำ เข้มข้น และแห้งโดยการระเหยสุญญากาศโรตารี่ใช้ 36 ° c (Rouini et al. 2006) สารสกัดแห้งชั่งน้ำหนัก และละลายในอะซีโตนน้ำ (1:9, v/v)2.3. เบื้องต้นคัดกรองสำหรับทดสอบป้องกันไฟสารสกัดจาก EtOAc จากแยก Trichoderma 128 ต้องกิจกรรมป้องกันไฟ ปลั๊กไฟ (เส้นผ่าศูนย์กลาง 0.6 ซม.) ตัดจากขอบของแผ่น cV8 ใช้มอดไม้ก๊อกเป็นหมันการเจริญเติบโตอย่างแข็งขัน และวาง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1.
บทนำประเภทเชื้อราTrichoderma เป็น ascomycetic เชื้อราที่พบในดิน (แอล 2006) เชื้อรา Trichoderma spp เป็นที่รู้จักกันควบคุมทางชีวภาพกับตัวแทน phytopathogens (Romão-Dumaresq et al., 2012) ยกตัวอย่างเช่นเชื้อรา Trichoderma harzianum, เชื้อรา Trichoderma virens และเชื้อรา Trichoderma viride จะวางตลาดในปัจจุบันเป็นตัวแทนควบคุมทางชีวภาพ กลไกสำหรับกิจกรรมต่อต้าน phytopathogen รวม antibiosis, mycoparasitism ทนต่อการชักนำและการยกเว้นเฉพาะ (แบ้ 2011) antibiosis เกี่ยวข้องกับการผลิตยาต้านจุลชีพของสารต่างๆที่ทำหน้าที่เป็นสารยับยั้งการเจริญเติบโตของ phytopathogen (Vinale et al., 2008) มากกว่า 100 สารต้านจุลชีพได้รับการระบุจากเชื้อรา Trichoderma spp (Vinale et al., 2008) ในระหว่างกระบวนการ mycoparasitism ที่ผนังเซลล์ phytopathogen จะสลายตัวโดยเซลล์เอนไซม์ย่อยสลายผนังที่ผลิตจากเชื้อรา Trichoderma (Reithner et al., 2011) มีการแข่งขันระหว่างเชื้อรา Trichoderma spp และ phytopathogens สำหรับเว็บไซต์ที่ติดเชื้อและสารอาหารที่เป็นที่รู้จักกันยกเว้นเฉพาะ. ประเภท Phytophthora เป็นเชื้อโรคพืชทำลายล้างที่ติดเชื้อเกือบทุกสายพันธุ์พืช (แฮนเซน et al., 2011) ใน 1861 DeBary ระบุ Phytophthora infestans เป็นตัวแทนสาเหตุทำลายมันฝรั่งปลายซึ่งเป็นผู้รับผิดชอบต่อความอดอยากมันฝรั่งไอริช (Raffaele et al., 2010) สายพันธุ์เชื้อรา Phytophthora มี oomycetes ซึ่งเป็นเชื้อราเหมือนจุลินทรีย์ eukaryotic ยังเป็นที่รู้จักแม่พิมพ์น้ำ มากกว่า 100 สายพันธุ์ของเชื้อรา Phytophthora มีเชื้อสาเหตุโรคพืชที่มีศักยภาพ เส้นใยเชื้อรา Phytophthora มีเส้นใยที่ไม่ได้แบ่งพาร์ติชันที่มีนิวเคลียสซ้ำหลาย ในขณะที่ไคตินเป็นส่วนประกอบหลักของผนังเซลล์เชื้อราβกลูแคนและเซลลูโลสเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของเชื้อรา Phytophthora ผนังเซลล์ สายพันธุ์เชื้อรา Phytophthora ผลิตแตกต่างกันของสปอร์ (oospores, chlamydospores และ zoospores) แต่ไม่สามารถสังเคราะห์ sterols ซึ่งเป็นเป้าหมายของการฆ่าเชื้อราหลาย (Gaulin et al., 2010) เป็นผลให้เชื้อโรคเชื้อรา Phytophthora เป็นการยากที่จะควบคุมการใช้สารฆ่าเชื้อราส่วนใหญ่มีอยู่ในปัจจุบัน นอกจากนี้สายพันธุ์เชื้อรา Phytophthora สามารถเอาชนะเจ้าหน้าที่ควบคุมสารเคมีและความต้านทานต่อโฮสต์พืชผ่านความยืดหยุ่นทางพันธุกรรม. ในการศึกษานี้เป็นไปได้สำหรับการใช้งานของสารเชื้อรา Trichoderma เป็นสารควบคุมทางชีวภาพกับเชื้อรา Phytophthora ถูกตรวจสอบ ทั้งหมด 128 สายพันธุ์เชื้อรา Trichoderma ถูกคัดกรองสำหรับกิจกรรมต่อต้านเชื้อรา Phytophthora ของตนโดยใช้สารสกัดจากน้ำนมที่แยกได้จากวัฒนธรรมของเหลว ยืนยันต่อไปแปดเลือกสายพันธุ์เชื้อรา Trichoderma ได้ดำเนินการโดยความเข้มข้นต่ำสุดแพร่ดิสก์และการทดสอบ antibiosis นอกจากนี้เราตรวจสอบการตอบสนองโมเลกุลและชีวเคมีของเชื้อรา Phytophthora และพืช (พริกไทยและมะเขือเทศ) หลังจากการประยุกต์ใช้สารสกัดจากน้ำนมของ KACC 40557. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 เชื้อรา Trichoderma และเชื้อรา Phytophthora แยกรวม128 สายพันธุ์เชื้อรา Trichoderma ที่ได้รับจากการบริหารงานพัฒนาชนบท (RDA) Genebank ศูนย์ข้อมูล (GIC) (ซูวอนสาธารณรัฐเกาหลี) (ไม่ได้แสดงข้อมูล) สายพันธุ์เชื้อรา Trichoderma ถูกปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซ์โทรสมันฝรั่ง (PDA) (Difco ประกาย, MD, USA) ที่ 25 ° C เป็นเวลา 14 วันภายใต้เงื่อนไขที่มืด เซเว่นสายพันธุ์เชื้อรา Phytophthora ได้รับการดูแลในวันที่ 20% ชี้แจง V8 (CV8) วุ้นน้ำ (น้ำ V8 20%, 8% CaCO3 1.5% Bacto วุ้น) ต่อไปนี้เจ็ดชนิดถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้: Phytophthora cactorum (KACC เกาหลีวัฒนธรรมการเกษตรสะสม 40,166) Phytophthora capsici (KACC 40157) Phytophthora drechsleri (KACC 40463) Phytophthora infestans (KACC 43071) Phytophthora melonis (KACC 40197) , Phytophthora nicotianae (KACC 44717) และเชื้อรา Phytophthora sojae (KACC 40412) สายพันธุ์เหล่านี้ถูกปลูกที่อุณหภูมิดังต่อไปนี้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของพวกเขา infestans พี, 18 ° C; พีพี cactorum sojae 25 ° C; capsici พีพี drechsleri, melonis พีพี nicotianae 30 ° C เชื้อได้รับการปลูกฝังมานาน 5-13 วันภายใต้เงื่อนไขที่มืด. 2.2 สารสกัดจากเชื้อรา Trichoderma ใช้เอทิลอะซิเตหลังจาก14 วันของการเจริญเติบโตน้ำหมัน (8 มิลลิลิตร) ถูกเทลงในจานและเส้นใยเก็บเกี่ยวจากรอยขีดข่วนโดยใช้ไม้แก้ว ปริมาณของเส้นใยเก็บเกี่ยวขึ้นอยู่กับสายพันธุ์; แต่ความเข้มข้นของสารสกัดเดียวกันถูกนำมาใช้ในการรักษา เส้นใยเก็บเกี่ยวถูกเทลงใน 500 มิลลิลิตรของน้ำซุปเกลือน้อยที่สุด (MIN) สื่อใน 1,000 มิลลิลิตรขวด Erlenmeyer และเติบโตขึ้นเป็นเวลา 14 วันที่ 25 ° C ที่ 150 รอบต่อนาที (เบ et al., 2011) ครึ่งหนึ่งของปริมาณของอะซิเตทเอทิล (EtOAc 250 มิลลิลิตร) ถูกเพิ่มเข้ามาในวัฒนธรรมของเหลวและเขย่าที่ 150 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที หลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่มโดยไม่ต้องสั่นชั้นบนถูกย้ายเข้าไปในขวดที่เข้มข้นและแห้งโดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุนสูญญากาศที่ 36 ° C (Rouini et al., 2006) สารสกัดแห้งชั่งน้ำหนักและละลายในน้ำอะซิโตน (1: 9, v / v). 2.3 การตรวจคัดกรองเบื้องต้นสำหรับการทดสอบการต้านเชื้อรา Phytophthora EtOAc สารสกัดจาก 128 สายพันธุ์เชื้อรา Trichoderma ถูกคัดกรองป้องกันเชื้อรา Phytophthora กิจกรรม ปลั๊ก Phytophthora (0.6 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลาง) ถูกตัดออกจากการเจริญเติบโตอย่างแข็งขันขอบของแผ่น CV8 ใช้หนอนเจาะก๊อกผ่านการฆ่าเชื้อแล้ววางไว้