2. Materials and methods2.1. Recomb

2. Materials and methods
2.1. Recombinant S-layer protein production
Recombinant S-layer protein of A. hydrophila was produced in
order to have sufficient protein for a vaccination trial.
2.1.1. Extraction of DNA from A. hydrophila
A. hydrophila isolate T4 was grown overnight according to
Poobalane et al. [30] and centrifuged at 5000×g for 5min at 4 ◦C.
The pellets were resuspended in 567l Tris ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) (TE) buffer (10mM Tris–Cl and 1mM EDTA,
pH 8), 30l of 10% (w/v) SDS and 3l of 20mgml−1 proteinase K.
The bacteria were thoroughly mixed and incubated for 1 h at 37 ◦C
before adding 100l of 5M NaCl. The pellets were mixed again
and incubated for 10 min at 65 ◦C after adding 80l cetyltrimethylammonium
bromide (CTAB) in NaCl solution (10%, v/v, CTAB in
0.7MNaCl). The DNA was extracted from the sample with an equal
volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1 ratio) (780l). The
tube was inverted a couple of times and centrifuged at 5000×g for
5min at 4 ◦C. The aqueous phase was transferred to a new tube and
extracted with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1 ratio).
The contents of the tube was thoroughly mixed and centrifuged at 5000×g for 10 min at 20–22 ◦C before transferring the aqueous
phase to a new tube. The DNA was precipitated with an equal volume
of isopropanol. The contents of the tube were then thoroughly
mixed by inverting the tube a couple of times and centrifuged at
5000×g for 10 min at 4 ◦C. The precipitate was washed with 70%
ethanol by centrifuging at 5000×g for 10 min at 4 ◦C. The supernatant
was removed and the pellets were briefly dried at 20–22 ◦C
for 10 min. The pellets were resuspended in 100l TE buffer and
stored at −20 ◦C until used.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. recombinant S ชั้นโปรตีนผลิตมีผลิต recombinant โปรตีนชั้น S ของ A. hydrophila ในสั่งให้โปรตีนเพียงพอสำหรับวัคซีนที่ทดลอง2.1.1 การสกัดดีเอ็นเอจาก A. hydrophilaA. hydrophila แยก T4 ถูกปลูกค้างคืนตามPoobalane et al. [30] และ centrifuged ที่ 5000 × g สำหรับที่ 4 ◦C 5 นาทีเกล็ดถูก resuspended ใน ethylenediaminetetraacetic ตรี 567 lบัฟเฟอร์ (EDTA) (TE) กรด (ตรี – Cl 10 มม.และ 1 มม. EDTApH 8), l 30 10% (w/v) SDS และ proteinase 20mgml−1 คุณ l 3แบคทีเรียถูกผสม ทั้ง incubated สำหรับ h 1 ที่ 37 ◦Cก่อนที่จะเพิ่ม 5 M NaCl 100 ลิตร เกล็ดถูกผสมอีกครั้งและ incubated สำหรับ 10 นาทีที่ 65 ◦C หลังเพิ่ม 80 l cetyltrimethylammoniumโบรไมด์ (CTAB) ในโซลูชัน NaCl (10%, v/v, CTAB ใน0.7MNaCl) ดีเอ็นเอถูกสกัดจากตัวอย่างด้วยเสมอปริมาณคลอโรฟอร์ม: isoamyl แอลกอฮอล์ (อัตราส่วน 24:1) (780 l) ที่หลอดถูกกลับสองครั้ง และ centrifuged ที่ 5000 × g สำหรับ5 นาทีที่ 4 ◦C ระยะอควีถูกถ่ายโอนไปหลอดใหม่ และสกัด ด้วยวาง: คลอโรฟอร์ม: isoamyl แอลกอฮอล์ (อัตรา 25:24:1)เนื้อหาของหลอดถูก centrifuged ที่ 5000 × g สำหรับ 10 นาทีที่ 20 – 22 ◦C และผสมอย่างละเอียดก่อนการโอนอควีตอนการหลอดใหม่ ดีเอ็นเอถูกตกตะกอน ด้วยปริมาณเท่ากันของ isopropanol เนื้อหาของหลอดได้แล้วอย่างละเอียดผสม ด้วยสีตรงกันข้ามท่อสองครั้ง และ centrifuged ที่กรัมซื้อ 5000 สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ◦C Precipitate ถูกล้าง ด้วย 70%เอทานอล โดย centrifuging ที่ 5000 × g สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ◦C Supernatantถูกเอาออก และอัดเม็ดได้สั้น ๆ แห้งที่ 20 – 22 ◦Cสำหรับ 10 นาที เกล็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ TE 100 l และเก็บไว้ที่ −20 ◦C จนใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 โปรตีน S-ชั้นผลิต
recombinant โปรตีน S-ชั้นของ A. hydrophila
ถูกผลิตในเพื่อที่จะได้โปรตีนที่เพียงพอสำหรับการทดลองฉีดวัคซีน.
2.1.1 การสกัดดีเอ็นเอจาก A. hydrophila
เอ hydrophila แยก T4 ปลูกในชั่วข้ามคืนตาม
Poobalane et al, [30] และหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมสำหรับ 5 นาทีที่ 4 ◦C.
เม็ดที่ถูก resuspended ใน 567? ลิตร Tris Ethylenediaminetetraacetic
กรด (EDTA) (TE) บัฟเฟอร์ (10 mM Tris-Cl และ 1 mM EDTA,
พีเอช 8), 30 ลิตร 10% (w / v) SDS และ 3 ลิตร 20mgml-1 โปรเคแบคทีเรียที่มีผสมและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง 37 ◦Cก่อนที่จะเพิ่ม100 ลิตร 5M โซเดียมคลอไรด์ เม็ดผสมอีกครั้งและบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 65 หลังจากที่เพิ่ม◦C 80 ลิตร cetyltrimethylammonium โบรไมด์ (CTAB) ในการแก้ปัญหาโซเดียมคลอไรด์ (10% v / V CTAB ใน0.7MNaCl) ดีเอ็นเอที่ถูกสกัดจากกลุ่มตัวอย่างที่มีค่าเท่ากับปริมาณของคลอโรฟอร์ม: isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (24: 1) (780 ลิตร) หลอดถูกคว่ำสองสามครั้งและหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมสำหรับ5 นาทีที่ 4 ◦C ในช่วงน้ำถูกย้ายไปเป็นหลอดใหม่และสกัดด้วยฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (25: 24: 1). เนื้อหาของหลอดที่ถูกผสมและหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีในวันที่ 20-22 ◦C ก่อนที่จะถ่ายโอนน้ำขั้นตอนที่จะเป็นหลอดใหม่ ดีเอ็นเอที่ได้รับการตกตะกอนกับปริมาณที่เท่ากันของ isopropanol เนื้อหาของหลอดได้อย่างละเอียดแล้วผสมโดย inverting หลอดสองสามครั้งและหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 ◦C ตะกอนถูกล้างด้วย 70% เอทานอลโดยเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 ◦C สารละลายจะถูกลบออกและเม็ดแห้งสั้นที่ 20-22 ◦Cเป็นเวลา10 นาที เม็ดที่ถูก resuspended ใน 100 ลิตรบัฟเฟอร์ TE และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ-20 ◦Cจนกว่าจะใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . การผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์โปรตีนรีคอมบิแนนท์ s-layer s-layer
A . hydrophila ผลิต
เพื่อมีโปรตีนเพียงพอสำหรับวัคซีนทดลอง .
2.1.1 . การสกัดดีเอ็นเอจาก A . hydrophila
A . hydrophila แยก T4 โตค้างคืนตาม
poobalane et al . [ 30 ] และระดับที่ 5 × G สำหรับ 5 นาทีที่◦
4 Cเม็ดเป็น resuspended ใน 567  l บริษัทบอน
acid ( EDTA ) ( TE ) บัฟเฟอร์ ( 10mm ) และบริษัท CL 1mm EDTA ,
pH 8 ) , 30  L 10 % ( w / v ) SDS และ 3  l 20mgml − 1 โปร K .
แบคทีเรียผสมอย่างทั่วถึงและโดยสำหรับ 1 ชั่วโมง 37 ◦ C
ก่อนที่จะเพิ่ม 100 ลิตร 5  เกลือ เม็ด มาผสมอีก
บ่มสำหรับ 10 นาทีที่ 65 ◦ C หลังจากเพิ่ม 80  cetyltrimethylammonium
lโบรไมด์ ( ctab ) ในสารละลาย NaCl ( 10% v / v ,
ctab ใน 0.7mnacl ) ดีเอ็นเอที่สกัดได้จากตัวอย่างที่มีปริมาตรเท่ากับ
คลอโรฟอร์ม : แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 24 : 1 อัตรา ) ( 780  L )
หลอดมันกลับหัวสองสามครั้งและระดับที่ 5 × g
5 นาทีที่ 4 ◦ C เฟสน้ำ ถูกย้ายไปเป็นหลอดใหม่และสกัดด้วยคลอโรฟอร์ม :
ฟีนอล : แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 25:24:1
อัตราส่วน )เนื้อหาของหลอดมันละเอียดผสมไฟฟ้าที่ 5000 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 20 – 22 ◦ C ก่อนโอนเฟสน้ำ
กับหลอดใหม่ ดีเอ็นเอตกตะกอนด้วย
ขนาดเท่ากัน ไอโซโพรพานอล . เนื้อหาของหลอดแล้วอย่างละเอียด
ผสมโดยกลับหัวหลอดสองสามครั้งและระดับที่ 5 × 10
กรัมสำหรับนาทีที่ 4 ◦ C ที่ซัก 70 %
เอทานอลโดยวรรณนาที่ 5000 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ◦ C สูง
ถูกลบออกและอัตราสั้นแห้งที่ 20 – 22 ◦ C
10 นาทีอัตรา resuspended 100  L TE บัฟเฟอร์ และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C
−◦จนใช้