RNA extraction and real-time PCRDee

RNA extraction and real-time PCR

Deep-frozen ovarian tissues were treated with RBC lysis buffer (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, and 0.1 mM EDTA) to remove red blood cells, homogenised, and centrifuged for 10 min at 3,000×g. Total RNA was extracted from the follicles using TRIzol, treated with DNAse according to the supplier’s instructions, and quantified by UV spectrophotometry. RNA purity was determined from A260/A280; a value between 1.8 and 2 indicated an RNA purity suitable for further analysis. First-strand cDNA was synthesised by reverse transcription of mRNA using the Oligo (dT) primer and Super Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Real time (RT)-PCR analysis of 25 μl reaction mixture containing SYBR Green was conducted using the LineGene K system (Bioer Technology, Tokyo, JPN). The primers used for RT-PCR are listed in Supplementary Table 1. The Rotor-Gene Real-Time Software 6.0 was used to analyse the results, and the cycle threshold (Ct) values plotted in logarithmic scale were used to compare RNA expression. Gene expression levels relative to GAPDH (a house-keeping gene) were calculated using the 2-ΔΔCt method.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกอาร์เอ็นเอและ PCR แบบเรียลไทม์รับ RBC lysis บัฟเฟอร์ (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3 และ 0.1 mM EDTA) เซลล์เม็ดเลือดแดง homogenised และ centrifuged เยือกเนื้อเยื่อรังไข่สำหรับ 10 นาที 3, 000 กรัม×อาร์เอ็นเอรวมสกัดจากรูขุมขนใช้ TRIzol รับ DNAse ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ quantified โดย UV spectrophotometry อาร์เอ็นเอบริสุทธิ์ถูกกำหนดจาก A260/A280 ค่าระหว่าง 1.8 และ 2 ระบุความบริสุทธิ์อาร์เอ็นเอที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม สแตรนด์แรก cDNA ถูก synthesised โดยย้อน transcription ของ mRNA ที่ใช้รองพื้น Oligo (dT) และซุปเปอร์สคริปต์ II กลับ Transcriptase (Invitrogen) เวลาจริง (RT) -วิเคราะห์ส่วนผสมปฏิกิริยา 25 μl ประกอบด้วย SYBR Green PCR ได้ดำเนินการใช้ระบบ LineGene K (Bioer เทคโนโลยี โตเกียว JPN) ไพรเมอร์ที่ใช้ RT-PCR อยู่ในตารางเสริมที่ 1 ใบพัดยีน Real-Time ซอฟต์แวร์ 6.0 ที่ใช้วิเคราะห์ผล และวงจรที่ใช้พล็อตในมาตราส่วนลอการิทึมค่าขีดจำกัด (Ct) ในการเปรียบเทียบนิพจน์อาร์เอ็นเอ ระดับนิพจน์ยีนที่สัมพันธ์กับ GAPDH (ยีนรักษาบ้าน) ถูกคำนวณโดยใช้วิธี 2 ΔΔCt

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดอาร์เอ็นเอและแบบ real-time PCR เนื้อเยื่อรังไข่ลึกแช่แข็งได้รับการรักษาด้วยการสลายบัฟเฟอร์ RBC (0.15 M NH4Cl 1 มิลลิ KHCO3 และ 0.1 มิลลิ EDTA) เพื่อขจัดเซลล์เม็ดเลือดแดง homogenised และปั่นเป็นเวลา 10 นาที 3,000 ×กรัม รวม RNA ถูกสกัดจากรูขุมขนโดยใช้ Trizol, การรักษาด้วย DNase ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและปริมาณโดย spectrophotometry รังสียูวี ความบริสุทธิ์ของอาร์เอ็นเอที่ถูกกำหนดจาก A260 / A280; ค่าระหว่าง 1.8 และ 2 แสดงให้เห็นถึงความบริสุทธิ์ของอาร์เอ็นเอที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ต่อไป cDNA แรกเส้นใยสังเคราะห์โดยถอดความย้อนกลับของ mRNA ใช้ Oligo (dT) ไพรเมอร์และซูเปอร์สคริปที่สองกลับ Transcriptase (Invitrogen) เวลาจริง (RT) การวิเคราะห์ -PCR 25 ไมโครลิตรผสมปฏิกิริยาที่มีสีเขียว SYBR ได้ดำเนินการโดยใช้ระบบ LineGene K (Bioer เทคโนโลยีโตเกียว JPN) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการ RT-PCR มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 เสริมโรเตอร์-ยีนซอฟแวร์แบบ Real-Time 6.0 ถูกใช้ในการวิเคราะห์ผลและเกณฑ์วงจร (CT) ค่าที่พล็อตในระดับลอการิทึมถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบการแสดงออกของอาร์เอ็นเอ ระดับการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์กับ GAPDH (ยีนบ้านรักษา) จะถูกคำนวณโดยใช้วิธีการ 2 ΔΔCt

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัด DNA PCR แบบเรียลไทม์และ

แช่แข็งลึกเนื้อเยื่อรังไข่ รักษาด้วยการสลายเม็ดเลือดแดง บัฟเฟอร์ ( 0.15 เมตร 4 . khco3 , 1 มม. และ 0.1 mM EDTA ) ลบเซลล์ เลือดสีแดง homogenised และไฟฟ้าสำหรับ 10 นาทีที่ 3000 ×กรัมรวม RNA ถูกสกัดจากรูขุมขนใช้ trizol การตรวจหา ADNase ตามคําแนะนํา , ของซัพพลายเออร์ และเชิงปริมาณ โดยวิธียูวีอาร์เอ็นเอความบริสุทธิ์ถูกกำหนดจาก a260 / a280 ; มูลค่าระหว่าง 1.8 2 พบว่ามี DNA บริสุทธิ์เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ต่อไป วิธีแรกคือเส้นสังเคราะห์โดยถอดความย้อนกลับของ mRNA ใช้โอลิโกเมอร์ ( DT ) และสคริปต์ซุปเปอร์ ii reverse transcriptase ( Invitrogen )เวลาจริง ( RT ) - การวิเคราะห์ PCR 25 μ L ปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย SYBR กรีนทดลองใช้ระบบ K linegene ( JPEG bioer เทคโนโลยี โตเกียว ) ไพรเมอร์ใช้วิธีอยู่ในโต๊ะเสริม 1 โรเตอร์ของเวลาจริงซอฟต์แวร์คือ 6.0 และใช้วิธีการสัมภาษณ์และวัฏจักรธรณี ( CT ) ค่าวางแผนในมาตราส่วนลอการิทึมเปรียบเทียบการแสดงออกของ RNAการแสดงออกของยีนในระดับที่สัมพันธ์กับ gapdh ( บ้านรักษายีน ) คำนวณโดยใช้ 2 - ΔΔวิธี CT .