2.6. Real-time RT-PCR assaysTo eval

2.6. Real-time RT-PCR assays
To evaluate mRNA level expression, real-time RT-PCR assays were prepared using the Rotor Gene 3000 real-time thermal cycler(Corbett Life Science Co.) at the laboratory of Floriculture Section,Leibniz University Hannover, Germany. The PCR reaction mixture was made up to a volume of 20 L containing 10 ng of cDNA tem-plate, 150 M of each dNTP, 0.25 M forward primer, 0.25 Mreverse primer (Table 1), 1 U of Taq DNA polymerase (Axon Co.),5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl and 50 mM KCl. PCR Amplification was monitored via intercalation of SYBR®Green (Roche Applied Science Co.) added to the reaction mixture in each tube. After 3 min of incubation at 94◦C, the cDNA was amplified by 40 three-step cycles: 30 s at 95◦C, 1 min at 61◦C, and 2 min at 72◦C. Each specific gene expression was quantified by normalization to -actin, a housekeeping gene, which concomitantly runs with specific genes’ primers. Specificity of the PCR amplification reaction was checked with a melting curve analysis (from 70 to 94◦C) following the final cycle, at the end of real-time PCR (Ahmadi et al., 2008).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 แบบเรียลไทม์ RT-PCR assaysการประเมินนิพจน์ระดับ mRNA, assays RT-PCR แบบเรียลไทม์มีเตรียมใช้ cycler ร้อนแบบเรียลไทม์ที่ 3000 ยีนใบพัด (คอร์เบตต์วิทยาศาสตร์ Co.) ในห้องปฏิบัติการของส่วนปลูกดอกไม้ Leibniz มหาวิทยาลัยฮันโนเวอร์ เยอรมนี ส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR ประกอบกับระดับ 20 L ประกอบด้วย 10 ฉบับของ tem cDNA-แผ่น 150 ม.ละ dNTP, 0.25 เมตรรองพื้นไปข้างหน้า รองพื้น Mreverse 0.25 (ตารางที่ 1), 1 U Taq DNA พอลิเมอเรส (บริษัทแอกซอน) 5 mM MgCl2 ทริ HCl 10 มม.และ 50 มม. KCl ปลักถูกตรวจสอบผ่าน intercalation SYBR®สีเขียว (Roche ใช้วิทยาศาสตร์ จำกัด) เพิ่มส่วนผสมของปฏิกิริยาในหลอด หลังจาก 3 นาทีบ่มที่ 94◦C, cDNA ที่ขยาย โดย 40 รอบสามขั้นตอน: 30 s 95◦C, 1 นาทีที่ 61◦C และ 2 นาทีที่ 72◦C แต่ละยีนที่เฉพาะถูกวัด โดยฟื้นฟูการ - แอกติน ยีนการทำความสะอาด ที่ concomitantly กับไพรเมอร์เฉพาะยีน ความปฏิกิริยา PCR ขยายการตรวจสอบ ด้วยการวิเคราะห์โค้งหลอม (จาก 70 94◦C) ต่อรอบสุดท้าย ที่สุดของ PCR แบบเรียลไทม์ (Ahmadi et al. 2008)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 แบบ Real-time RT-PCR การตรวจ
เพื่อประเมินการแสดงออกระดับ mRNA แบบ real-time RT-PCR ตรวจได้จัดทำขึ้นโดยใช้โรเตอร์ยีน 3000 เวลาจริง Cycler ความร้อน (Corbett วิทยาศาสตร์ชีวภาพ จำกัด ) ที่ห้องปฏิบัติการของการปลูกดอกไม้มาตรา Leibniz มหาวิทยาลัยฮันโนเวอร์ ประเทศเยอรมัน ผสมปฏิกิริยา PCR ที่ถูกสร้างขึ้นมาจากปริมาณจาก 20? L บรรจุ 10 NG ของยีน TEM แผ่น 150 M ของแต่ละ dNTP, 0.25 m? ไพรเมอร์ไปข้างหน้า, 0.25? Mreverse ไพรเมอร์ (ตารางที่ 1) 1 U ของ Taq DNA โพลิเมอร์ (Axon co.) 5 มิลลิ MgCl2 10 มิลลิ Tris-HCl และ 50 มิลลิ KCl ขยาย PCR ได้รับการตรวจสอบผ่านเสพของSYBR®Green (Roche วิทยาศาสตร์ประยุกต์ จำกัด ) เพิ่มไปยังผสมปฏิกิริยาในแต่ละหลอด หลังจาก 3 นาทีของการบ่มที่94◦Cที่ cDNA ถูกขยายจาก 40 รอบขั้นตอนที่สาม: 30 วินาทีที่95◦C 1 นาทีที่61◦Cและ 2 นาทีที่72◦C แต่ละการแสดงออกของยีนที่เฉพาะเจาะจงได้รับการวัดโดยการฟื้นฟูเพื่อ? -actin, ยีนบริการทำความสะอาด, ที่ร่วมกันทำงานกับไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง ความจำเพาะของปฏิกิริยาขยาย PCR ถูกตรวจสอบด้วยการวิเคราะห์โค้งละลาย (จาก 70 ถึง94◦C) ดังต่อไปนี้รอบสุดท้ายในตอนท้ายของ Real-time PCR (ที่ Ahmadi et al., 2008)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 เวลาจริงนี้พยายามเพื่อประเมินการแสดงออกระดับ mRNA เรียลไทม์ RT-PCR ) เตรียมใช้โรเตอร์แบบเรียลไทม์ ( Thermal cycler คอร์เบตต์ยีน 3000 ชีวิตวิทยาศาสตร์ Co . ) ที่ห้องปฏิบัติการของมหาวิทยาลัย ส่วนการปลูกดอกไม้ไลบ์นิซ , ฮันโนเวอร์ , เยอรมนี การตรวจปฏิกิริยาผสม ทำให้ปริมาณ 20 ลิตร บรรจุ 10 กรัมของ cDNA เต็มจาน , 150 เมตรของแต่ละ dntp 0.25 m ส่งต่อรองพื้น 0.25 mreverse รองพื้น ( ตารางที่ 1 ) 1 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( AXON Co . ) , MgCl2 5 มม. หรือ 10 มม. และโพแทสเซียม HCL 50 มม. โดยการขยายผ่าน intercalation ของ SYBR ®สีเขียว ( โรชวิทยาศาสตร์ประยุกต์ Co . ) เพิ่มปฏิกิริยาผสมในแต่ละหลอด หลังจาก 3 นาทีของการบ่มที่ 94 ◦ C วิธีคือโดยขยาย 40 3 รอบ 30 s 95 ◦ C 1 นาทีที่ 61 ◦ C และ 2 นาทีที่ 72 ◦ C แต่ละยีนเป็น quantified โดยบรรทัดฐาน - actin , แม่บ้าน ยีน ซึ่งเป็นทีมที่วิ่งเฉพาะยีน " ไพรเมอร์ . ของปฏิกิริยา PCR แบบเฉพาะเจาะจงคือเช็คกับจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้ง ( 70 94 ◦ c ) ตามรอบสุดท้าย ในตอนท้ายของ PCR แบบเรียลไทม์ ( อะห์มาดี et al . , 2008 )