Materials and MethodsAnimals and ti

Materials and Methods
Animals and tissues
Sea cucumbers, Cucumaria frondosa, were
collected in the Gulf of Maine during the
month of September and were maintained for
up to 2 months before sacrifice in the constantly
flowing fresh seawater system at
Mount Desert Island Biological Laboratory
(Salsbury Cove, ME, USA). The temperature
of the seawater was approximately 12” to
15°C. All studies were performed on pieces of
white inner dermis from the two ventral interambulacral
regions, lacking podia (Hyman,
1955). The attached inner muscular layer was
pulled off with tweezers, and the pigmented
outer dermis was removed with a razor blade.
The tissue was cut into pieces approximately 1
x 3 x 10 mm, weighed, and stored at -70°C.
Manipulation of the animal during the above
procedures caused the dermis to stiffen. If it
was desired instead to start with relaxed dermis,
the animal was placed for approximately
4 h in natural sea water diluted 1: 1 with 0.6 M
MgCIZ (Dales, 1970). This treatment produced
“narcosis” of the animal, and the dermis remained
compliant during dissection and after
being thawed.
Isolation and purzjication of whole collagen
jibrils from sea cucumber dermis
Approximately 50 g of inner dermis were
thawed and stirred in 1 L of deionized water
at 4°C for 30 min. The water was discarded
and replaced with an equal volume of fresh
deionized water. After this mixture had been
stirred at 4°C for 1 h, the water was replaced
and the extraction in water repeated once
more. The water was then replaced with 1 L
of 4 mM ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA), 0.1 M Tris HCl, pH 8.0, and stirred
overnight. The tissue remained compact in the
EDTA solution. The liquid was decanted and
replaced with 1 L of deionized water, in which
the tissue was stirred slowly for 15 min. The
liquid was decanted, replaced with fresh water,
and the washing steps were repeated
twice more. The liquid was then replaced with
500 ml of fresh deionized water, and the mixture
was stirred slowly overnight. The next
day the mixture consisted of pieces of swollen
dermis in a cloudy fluid. The fluid was decanted
and centrifuged for 30 min at 1,000 x
G. The top */3 of the centrifuge bottle contents,
containing free collagen fibrils, was collected,
and the rest was recombined with the pieces
of dermis. This mixture was stirred overnight
in sufficient fresh deionized water to make the
total volume 500 ml, after which the isolated
fibrils were collected as described above.
These stirring and collection steps were repeated
at least two more times, or until the
yield of free fibrils began to drop, as determined
by visual inspection. The combined supernatants
were analyzed for hydroxyproline
content, and then were diluted with water to
a collagen concentration of 0.3 mg/ml, based
on the finding that hydroxyproline accounts
for 7.7% of the mass of the collagen molecules
from this tissue (see Table 4). The fibril suspension,
designated “crude fibril preparation,”
was made 0.02% in NaN3 and stored at
4°C.
The fibrils were separated from soluble
components by repeated centrifugation
(27,000 x g for 30 min) and resuspension in
water until the lyophilized supernatant contained
no residue that could be detected by
visible inspection. The resulting suspension
was designated “water-extracted fibrils.” The
fibrils were thoroughly separated from noncovalently
associated macromolecules by extraction
for 24 to 48 h in 3 M guanidine-HCl
in 50 mM Na-acetate buffer, pH 6.0. The fibrils
were collected by centrifugation at
27,000 x g for 30 min and resuspended in water
by gentle rocking for 1 h. The centrifugation
and water suspension steps were repeated
twice more to remove the salts. It was important
to avoid vigorous stirring throughout the
procedures in order to keep the fibrils from
becoming entangled. The resulting suspension
was designated “guanidine-extracted fibrils.”
In some experiments, to insure maximal extraction
of nonfibrillar molecules, the concentration
of guanidine-HCl used was 6 M instead
of3M.
Cuprolinic blue staining of surface GAGS
Cuprolinic blue staining and electron microscopic
visualization of sulfated polyanions on
the surfaces of isolated collagen fibrils were
based on the method of Scott and Orford
(1981) and were carried out as described previously
(Trotter and Koob, 1989). The MgCl,
concentration was either 0.3 M or 1M.
Collagenase digestion
Guaninidine-washed fibrils or collagen samples,
containing collagen at a concentration of
approximately 300 pglml, were suspended in
or exchanged by dialysis into collagenase
buffer (50 mM Tris, 10 mM CaCl,, pH 8.0).
Phenylmethyl-sulfonyl fluoride (PMSF) and
N-ethylmaleimide (NEM) were added to give
final concentrations of 0.2 mM and 4 mM, respectively,
and the samples were incubated
for 30 min. in a 65°C oven. The samples were
cooled to room temperature, and collagenase
buffer containing 239 BTC units/ml of collage

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ
สัตว์และเนื้อเยื่อ
ซีแตงกวา Cucumaria frondosa ถูก
อ่าวเมนในระหว่างการรวบรวม
เดือนกันยายน และถูกรักษาไว้สำหรับ
2 เดือนก่อนที่จะเสียสละในตลอดเวลา
ไหลทะเลสดระบบ
ภูเขาทะเลทรายเกาะห้องปฏิบัติการชีวภาพ
(Salsbury โคฟ ME สหรัฐอเมริกา) อุณหภูมิ
ของน้ำทะเลมีประมาณ 12"
15 องศาเซลเซียส ดำเนินการศึกษาทั้งหมดบนชิ้น
ผิวหนังภายในสีขาวจาก ventral สอง interambulacral
ภูมิภาค ขาด podia (Hyman,
1955) ชั้นกล้ามเนื้อด้านในที่แนบถูก
ดึงออก ด้วยปากคีบ ที่มีสี
ผิวหนังภายนอกถูกเอาออก ด้วยใบมีดโกน
เนื้อเยื่อถูกตัดเป็นชิ้นประมาณ 1
x 3 x 10 มิลลิเมตร น้ำหนัก และจัดเก็บที่ -70 ° C.
การจัดการสัตว์ในระหว่างด้านบน
ขั้นตอนเกิดผิวหนังเพื่อ stiffen ถ้ามัน
ถูกต้องแต่จะเริ่มต้นด้วยผ่อนคลายผิวหนัง,
สัตว์ถูกวางในประมาณ
4 h ในน้ำทะเลธรรมชาติผสม 1:1 กับ 0.6 M
MgCIZ (Dales, 1970) รักษานี้ผลิต
"narcosis" ของสัตว์ และผิวหนังยังคง
ตาม ระหว่างชำแหละ และหลัง
กำลัง thawed.
แยกและ purzjication ของคอลลาเจนทั้งหมด
jibrils จากหนังแท้ปลิง
ประมาณ 50 g ของผิวหนังภายในมี
thawed และกวนในน้ำ deionized L 1
ที่ 4° C ใน 30 นาที น้ำถูกละทิ้ง
และแทนที่ ด้วยปริมาณเท่ากันของสด
น้ำ deionized หลังจากที่ผสมนี้ได้
กวนที่ 4° C สำหรับ 1 h น้ำถูกแทน
และสกัดน้ำซ้ำอีกครั้ง
เพิ่มเติม น้ำถูกแทนที่ ด้วย 1 L แล้ว
ของ 4 มม. ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA) ทริสเรทติ้ง 0.1 M HCl, 8.0 และคน
นอน เนื้อเยื่อยังคงกระชับในการ
EDTA โซลูชัน ของเหลวถูก decanted และ
ถูกแทนที่ ด้วยน้ำ deionized ที่ 1 L
เนื้อเยื่อเป็นกวนช้าสำหรับ 15 นาที
เหลวถูก decanted แทนที่ ด้วยน้ำ,
และทำซ้ำขั้นตอนซักผ้าถูก
เพิ่มเติมสองครั้ง ของเหลวถูกแทนที่ด้วยแล้ว
ขนาด 500 มล.น้ำ deionized และส่วนผสม
กวนช้าค้างคืน ถัดไป
วันผสมประกอบด้วยชิ้นส่วนของบวม
หนังแท้ในน้ำมันมีเมฆมาก น้ำถูก decanted
และ centrifuged ใน 30 นาทีที่ 1000 x
G ด้านบน * / 3 ของเครื่องหมุนเหวี่ยงขวดเนื้อหา,
ประกอบด้วย fibrils ฟรีคอลลาเจน ที่เก็บ,
และส่วนเหลือถูก recombined กับชิ้น
ของผิวหนัง กวนส่วนผสมนี้ได้ค้างคืน
พอน้ำ deionized สดต้อง
รวมปริมาตร 500 ml หลังจากที่แยก
fibrils ถูกเก็บรวบรวมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
ดังกวนและคอลเลกชันถูกซ้ำ
น้อยสองเพิ่มเติมเวลา หรือจนกว่า
ผลตอบแทนของ fibrils ฟรีเริ่มปล่อย ตาม
โดยตรวจสอบภาพ Supernatants รวม
ถูกวิเคราะห์สำหรับ hydroxyproline
เนื้อหา และจากนั้น ก็ผสมกับน้ำ
คอลลาเจนเข้มข้นของ 0.3 mg/ml ตาม
ในการค้นหาบัญชีที่ hydroxyproline
7.7% ของมวลของโมเลกุลคอลลาเจน
จากเนื้อเยื่อนี้ (ดูตาราง 4) ระงับ fibril,
กำหนด "เตรียม fibril ดิบ
ทำ 0.02% NaN3 และเก็บที่
4 ° C.
fibrils ถูกแยกออกจากละลาย
ส่วนประกอบ โดย centrifugation ซ้ำ
(27000 x g ใน 30 นาที) และ resuspension ตะกอนใน
น้ำจนกระทั่ง supernatant lyophilized อยู่
ไม่มีสารตกค้างที่อาจตรวจพบโดย
ตรวจเห็น การระงับผล
ถูกกำหนด "น้ำสกัด fibrils "
Fibrils ทำแยกจาก noncovalently
สัมพันธ์ macromolecules โดยสกัด
ใน 24 ถึง 48 h ใน 3 M guanidine HCl
ในบัฟเฟอร์ acetate นา 50 มม. ค่า pH 6.0 Fibrils
ถูกรวบรวม โดย centrifugation ที่
27, 000 x g 30 นาทีและ resuspended ในน้ำ
โดยโยกเบา ๆ สำหรับ 1 h ที่ centrifugation
และทำซ้ำขั้นตอนระงับน้ำได้
สองครั้งมากขึ้นเพื่อเอาเกลือ ก็สำคัญ
เพื่อหลีกเลี่ยงการกวนคึกคักตลอดการ
ตอนให้ fibrils จาก
กลายเป็นเกี่ยว การระงับได้
ได้กำหนด "สกัด guanidine fibrils"
ในบางการทดลอง การประกันสูงสุดแยก
nonfibrillar โมเลกุล ความเข้มข้นของ
ของ guanidine HCl ใช้ถูก 6 M แทน
of3M.
Cuprolinic สีน้ำเงินย้อมสีของ GAGS ผิว
Cuprolinic ฟ้าย้อมสีและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
แสดงภาพประกอบเพลงของ polyanions sulfated บน
ถูกพื้นผิวของคอลลาเจนแยก fibrils
ตามวิธีของสก็อตและ Orford
(1981) และได้ดำเนินการออกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
(Trotter และ Koob, 1989) MgCl,
มีความเข้มข้น 0.3 M หรือ 1 ม.
Collagenase ย่อยอาหาร
fibrils ล้าง Guaninidine หรือตัวอย่างคอลลาเจน,
ประกอบด้วยคอลลาเจนที่เข้มข้นของ
pglove ประมาณ 300 ชีวิต ถูกหยุดชั่วคราวใน
หรือแลกเปลี่ยน โดยหน่วยเป็น collagenase
บัฟเฟอร์ (50 mM ตรี 10 mM, CaCl pH 8.0) .
Phenylmethyl sulfonyl ฟลูออไรด์ (PMSF) และ
N-ethylmaleimide (ลมอนสแกน) เพิ่มให้
สุดท้ายความเข้มข้น 0.2 มม.และ 4 มม. ตามลำดับ,
และตัวอย่างที่ incubated
ใน 30 นาทีในเตาอบ 65 ° C ตัวอย่างดี
ระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิห้อง และ collagenase
บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 239 บีทีซีหน่วย/มล.ของภาพตัดปะ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการ

ทะเลสัตว์และเนื้อเยื่อแตงกวา cucumaria frondosa ,
เก็บในอ่าวเมน ในช่วงเดือนกันยายนและ

ประมาณถึง 2 เดือนก่อนที่จะสละในน้ำทะเลที่ไหลตลอดเวลา

ภูเขาทะเลทรายสดระบบห้องปฏิบัติการทางชีวภาพเกาะ
( salsbury Cove , ฉัน , สหรัฐอเมริกา . อุณหภูมิของน้ำทะเลประมาณ 12

" ถึง 15 องศาการศึกษาจำนวนชิ้นของ
หนังแท้สีขาวด้านในจากสอง ) interambulacral
ภูมิภาคขาดโปเดีย ( ไฮแมน
1955 ) แนบกล้ามเนื้อชั้นในชั้น
ดึงออกด้วยแหนบ และหนังแท้ด้านนอกมีสี
ถูกลบออกด้วยใบมีดโกน .
เนื้อเยื่อถูกหั่นเป็นชิ้นประมาณ 1
x 3 x 10 มิลลิเมตร น้ำหนัก และเก็บที่อุณหภูมิ - 70 องศา C .
การจัดการของสัตว์ระหว่างข้างบน
วิธีการทำให้ผิวหนังแข็ง . ถ้ามันมีที่ต้องการแทน

เริ่มผ่อนคลายด้วยหนังแท้ , สัตว์ที่ถูกวางไว้ประมาณ
4 H ในทะเลธรรมชาติน้ำเจือจาง 1 : 1 กับ 0.6 M
mgciz ( เดลส์ , 1970 ) การรักษานี้ผลิต
" เวอร์ นาร์โคซิน " ของสัตว์ และหนังแท้ อยู่ในระหว่างและหลัง

ตามการทำละลาย .
การแยกและ purzjication
ทั้งคอลลาเจนjibrils จากปลิงทะเลหนังแท้
ประมาณ 50 กรัม ) ละลายภายในหนังแท้
กวนใน 1 ลิตรของน้ำ
ที่ 4 คล้ายเนื้อเยื่อประสาน°องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที น้ำถูกทิ้งและถูกแทนที่ด้วยปริมาณเท่ากัน

คล้ายเนื้อเยื่อประสานสด น้ำ หลังจากส่วนผสมนี้มี
กวน 4 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง น้ำที่ถูกแทนที่
และการสกัดน้ำซ้ำเมื่อ
เพิ่มเติม น้ำถูกแทนที่ด้วย
1 l4 มิลบอนกรด
( EDTA ) , 0.1 M HCl ซึ่ง pH 8.0 และกวน
ค้างคืน เนื้อเยื่อที่ยังคงกระชับใน
EDTA โซลูชั่น ของเหลวที่ถูกแทนที่ด้วยรินและ
1 l คล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำซึ่งในเนื้อเยื่อที่ถูกกวน

ช้า 15 นาทีของเหลวริน ถูกแทนที่ด้วยน้ำสด
และขั้นตอนการล้างก็ซ้ำ
เป็นสองเท่า ของเหลวที่ถูกแทนที่ด้วย
500 มิลลิลิตรของน้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสานสด และส่วนผสม
ถูกกวนช้าๆข้ามคืน วันถัดไป
ส่วนผสมประกอบด้วยชิ้นบวม
หนังแท้ในของเหลวขุ่น ของเหลวที่ถูกริน
ไฟฟ้าสำหรับ 30 นาทีที่ 1 , 000 x
กรัมด้านบน * / 3 ของขวดซึ่งเนื้อหา
ที่มีฟรีใยคอลลาเจนได้รวบรวม
ที่เหลือก็น้ำนมกับชิ้น
ของหนังแท้ส่วนผสมนี้จะกวนในน้ำข้ามคืน
เพียงพอสดคล้ายเนื้อเยื่อประสานให้
ปริมาณ 500 มิลลิลิตร ซึ่งหลังจากแยก
ไฟบริลศึกษา ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น .
เหล่านี้ตื่นเต้นและคอลเลกชันก้าวซ้ำ
อย่างน้อย 2 ครั้ง หรือจนกว่า
ผลผลิต fibrils ฟรีเริ่มลดลงเมื่อพิจารณา
โดยการตรวจสอบ ภาพ

supernatants รวมวิเคราะห์ไฮดรอกซิโพรลีนเนื้อหา และจากนั้นถูกเจือจางด้วยน้ำความเข้มข้น 0.3 มล.
คอลลาเจนมก. / ตาม
บนพบว่าบัญชีไฮดรอกซิโพรลีน
สำหรับ 7.7% ของมวลของคอลลาเจนโมเลกุล
จากเนื้อเยื่อนี้ ( ดูตารางที่ 4 ) โดยไฟบริลระงับ
เขตเตรียมดิบไฟบริล "
ทำ 0.02 % ใน nan3 ที่เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C .

ไฟบริลแยกจากละลาย

3 องค์ประกอบด้วยซ้ำ( 27 , 000 x G สำหรับ 30 นาที ) และ resuspension ใน
น้ำจนแห้ง ไม่มีสารตกค้าง ที่นำอยู่

สามารถตรวจพบได้โดยการตรวจสอบการมองเห็น ผลการระงับ
เป็นเขต " น้ำสกัดไฟบริล "
ไฟบริลโดยแยกจากโมเลกุลที่เกี่ยวข้องโดยการสกัด noncovalently

สำหรับ 24 ถึง 48 ชั่วโมงใน 3 M กัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์
ใน 50 mm na อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 6.0 .การ fibrils
มีจำนวน 27 , 000 x g
3 ที่ 30 นาทีและ resuspended ในน้ำ
โดยโยกเบาๆ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และน้ำปั่น
ขั้นตอนระงับเป็นเวลา
อีกสองครั้ง เอาเกลือ มันเป็นสิ่งสำคัญเพื่อหลีกเลี่ยงคึกคักเร้าใจตลอด

ขั้นตอนในการสั่งซื้อเพื่อให้ไฟบริลจาก
กลายเป็นรักสามเส้า . ผลการระงับ
เป็นเขต " กัวนิดีนสกัดไฟบริล "
ในบางการทดลองเพื่อประกัน
การสกัดสูงสุดของโมเลกุล nonfibrillar ความเข้มข้นของ HCl กัวนิดีนใช้
6 M แทน
of3m .
cuprolinic สีฟ้าคราบผิวมุก
cuprolinic สีฟ้า staining และจุลทรรศน์อิเลคตรอนของซัลเฟตต่อ

ภาพ polyanions พื้นผิวของแยกใยคอลลาเจนคือ
ตามวิธีของ Scott และออร์เฟิร์ด
( 1981 ) และได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
( เท้า และ คูบ , 1989 ) ที่เนทความเข้มข้น 0.3 M
, อย่างใดอย่างหนึ่งหรือ 1M .

guaninidine fibrils คอลลาเจนการย่อยอาหารล้างหรือตัวอย่าง คอลลาเจน ประกอบด้วยคอลลาเจนที่เข้มข้น

ประมาณ 300 pglml ถูกระงับใน
หรือแลกเปลี่ยนโดยการฟอกไตเป็นคอลลาจีเนส
บัฟเฟอร์ ( 50 มม. นอกจากนี้ CaCl 10 มม.pH 8.0 )
phenylmethyl sulfonyl ฟลูออไรด์ ( PMSF )
n-ethylmaleimide ( NEM ) เพิ่มให้
ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.2 มม. และ 4 มม. ตามลำดับ และจำนวนเชื้อ

30 นาที 65 ° C เตาอบ จำนวน
เย็นที่อุณหภูมิห้องและคอลลาเจน
บัฟเฟอร์ที่มี 239 BTC หน่วยมิลลิลิตรเรขาคณิต