For further confirmation of insect

For further confirmation of insect species, genomic DNA was extracted from the maggots collected from both the pig and victim’s corpses
using QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc., Valencia,
CA, USA). Each maggot was ground into powder
using a disposable plastic pestle inside a 1.5 mL
microfuge tube immersed in liquid nitrogen.
The DNA extracted was used as template DNA
for PCR reactions. The region of mitochondrial
cytochrome oxidase b subunit I (COI) gene was
amplified using primers 2495 (5′-CAGCTACTTTATGAGCTTTAG-3′) and 2800 (5′-CATTTCAAGT/
CTGTGTAAGCAT-3′).10 An aliquot of PCR reaction solution comprised 5 µL of 10X PCR buffer
(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM
MgCl2), 8 µL of 1.25 mM dNTP mixture, 5 µL of
1.5 µM forward and reverse primers, 2.5 units of
Taq DNA polymerase, 10 ng of DNA, and distilled
water to a final volume of 50 µL. The PCR conditions were as follows: 35 cycles of 94°C for
1 minute, 45°C for 1 minute, and 72°C for 1.5
minutes. A PCR fragment of 305 bp was amplified.
Prior to the sequencing reaction, the PCR products were purified using a QIAquick® PCR purification kit (QIAGEN Inc.). Cycle sequencing was
performed using 3.0 µL of ABI Prism Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
solution with AmpliTaq FS DNA polymerase
(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับเพิ่มเติมการยืนยันสายพันธุ์ ถูกแยก DNA ออกจากหนอนที่เก็บมาจากหมูและศพของเหยื่อใช้ชุดดีเอ็นเอ QIAamp (QIAGEN Inc. วาเลนเซียCA, USA) ตัวหนอนแต่ละถูกบดเป็นผงใช้สากแบบพลาสติกทิ้งภายใน 1.5 mLหลอด microfuge ที่แช่อยู่ในไนโตรเจนเหลวใช้เป็นแม่แบบดีเอ็นเอดีเอ็นเอที่สกัดสำหรับปฏิกิริยา PCR ภูมิภาคของยลงานย่อย b cytochrome oxidase ฉัน (COI) ยีนคือขยายโดยใช้ไพรเมอร์ปี 2495 (5 ′-CAGCTACTTTATGAGCTTTAG-3′) และ 2800 (5 ′-CATTTCAAGT /CTGTGTAAGCAT-3′) .10 เป็นส่วนลงตัวของปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 5 µL ของบัฟเฟอร์ X PCR 10(10 มมทริสเรทติ้ง HCl, pH 8.3, KCl, 1.5 มม. 50 มม.MgCl2), 8 µL ผสม dNTP 1.25 มม. 5 µL ของ1.5 µM ไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ 2.5 หน่วยTaq DNA พอลิเมอเรส 10 ฉบับของดีเอ็นเอ และกลั่นน้ำที่มีปริมาตรสุดท้ายของ 50 µL เงื่อนไข PCR มีดังนี้: 94° C สำหรับรอบ 351 นาที 45° C 1 นาที และ 72° C สำหรับ 1.5นาที ส่วน PCR ของ 305 bp ได้ขยายก่อนปฏิกิริยาลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์ใช้ชุดฟอก QIAquick® PCR (QIAGEN Inc.) แก้ไขลำดับวงจรดำเนินการโดยใช้ 3.0 µL ของ ABI ปริซึมใหญ่ย้อมเทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับปฏิกิริยาพร้อมแก้ปัญหา ด้วย AmpliTaq FS ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส(PE ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ เมืองฟอสเตอร์ CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อยืนยันต่อไปของแมลงชนิดดีเอ็นเอถูกสกัดจากหนอนที่เก็บรวบรวมจากทั้งหมูและศพของเหยื่อ
โดยใช้ชุดดีเอ็นเอ QIAamp (QIAGEN อิงค์วาเลนเซีย,
CA, USA) แต่ละตัวอ่อนของแมลงที่ถูกบดเป็นผง
ใช้สากพลาสติกทิ้งภายใน 1.5 มล
หลอด microfuge แช่อยู่ในไนโตรเจนเหลว.
ดีเอ็นเอที่สกัดถูกใช้เป็นดีเอ็นเอแม่แบบ
สำหรับปฏิกิริยา PCR ภูมิภาคของยล
subunit cytochrome oxidase B I (COI) ยีน
ขยายโดยใช้ไพรเมอร์ 2495 (5'-CAGCTACTTTATGAGCTTTAG-3) และ 2800 (5'-CATTTCAAGT /
CTGTGTAAGCAT-3 '). 10 หารของการแก้ปัญหาการเกิดปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 5 ไมโครลิตรของ 10X PCR บัฟเฟอร์
(10 mM Tris-HCl ค่า pH 8.3 ขนาด 50 มมโพแทสเซียมคลอไรด์ 1.5 มิลลิ
MgCl2), 8 ไมโครลิตร 1.25 มิลลิ dNTP ผสม 5 ไมโครลิตรของ
1.5 ไมครอนไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์, 2.5 หน่วย
Taq DNA Polymerase 10 NG ดีเอ็นเอและกลั่น
น้ำปริมาณสุดท้ายของ 50 ไมโครลิตร เงื่อนไข PCR มีดังนี้ 35 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
1 นาที 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.5
นาที ส่วนวิธี PCR 305 bp ถูกขยาย.
ก่อนที่จะมีปฏิกิริยาลำดับผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอกQIAquick® PCR (QIAGEN อิงค์) วงจรลำดับได้รับการ
ดำเนินการโดยใช้ 3.0 ไมโครลิตรของ ABI ปริซึมบิ๊กย้อม
ปฏิกิริยา Terminator วงจรลำดับพร้อม
วิธีการแก้ปัญหาที่มี AmpliTaq FS DNA Polymerase
(PE Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการยืนยันต่อไปของแมลงชนิด สกัดดีเอ็นเอจากหนอนที่รวบรวมจากทั้งหมูและศพของเหยื่อใช้ชุดดีเอ็นเอ qiaamp ( QIAGEN อิงค์ , บาเลนเซียแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) แต่ละหนอนคือพื้นดินให้เป็นผงใช้สากพลาสติกทิ้งภายใน 1.5 มิลลิลิตรหลอด microfuge แช่ในไนโตรเจนเหลวDNA ที่สกัดมาใช้เป็นดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับปฏิกิริยา PCR ภูมิภาคของลนกลุมพู บี 1 ชั้น ( ลำปาง ) ยีน คือขยายการใช้ไพรเมอร์และ ( 5 cagctactttatgagctttag-3 ’ - ’ ) และ 2 , 800 ( 5 ’ - catttcaagt /ctgtgtaagcat-3 School ) 10 เป็นส่วนลงตัวของสารละลายปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 5 µผม 10x และบัฟเฟอร์( 10 มม. นอกจากนี้ HCl , pH 8.3 , 50 mm . 1.5 มม.ชุด ) , 8 µลิตรผสม dntp 1.25 มม. , 5 µล.1.5 µ M ไปข้างหน้าและย้อนกลับจาก 2.5 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค , 10 นาโนดีเอ็นเอ และกลั่นน้ำสุดท้ายปริมาตร 50 ลิตร สภาพµ PCR ดังนี้ 35 รอบ 94 ° C สำหรับ1 นาที 45 ° C เป็นเวลา 1 นาที และ 72 ° C สำหรับนาที เป็นเทคนิคส่วน 305 เบสเบส .ก่อนที่จะจัดลำดับปฏิกิริยาที่เพิ่มปริมาณการใช้เชื้อบริสุทธิ์บริสุทธิ์ qiaquick ®ชุด ( เพิ่ม ) ) ลำดับวงจรการใช้µ 3.0 ลิตร ABI ปริซึมใหญ่สีTerminator รอบลำดับปฏิกิริยาพร้อมโซลูชั่น amplitaq FS DNA polymerase( PE Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา