3.3. Impact of strain genotype on p

3.3. Impact of strain genotype on pDNA purificationWhile the choice of production strain directly affects the pDNAfermentation yield, it might affect pDNA purification as well as aresult of alterations in the ratio between plasmid and impurities.As earlier reviewed, strain engineering can increase pDNA per-centage per cell, reduce genomic DNA and RNA impurities, anddecrease process stream or lysate viscosity (Bower and Prather,2009). Moreover, a carefully designed strain may result in improvedplasmid improvedplasmid topology and segregational stability, and eventually con-tribute to increased transfection efficiency of the final plasmidproduct (Gonc¸ alves et al., 2012). The experiments described in thissection were designed to evaluate the impact of strain genotype onthe purification and final quality of pDNA. Fed-batch fermentationswere first performed with the three strains using the same feed-ing strategy and conditions (see Section 2). Plasmid DNA was thenpurified from the harvested biomass using a process that combinesalkaline lysis, isopropanol and ammonium sulfate precipitation,hydrophobic interaction chromatography (HIC) and size exclusion(adapted from Diogo et al., 2000).A number of differences were observed among the three strainsin terms of process yield and quality of final product (Table 2). AnHPLC analysis showed that clarified lysates obtained from GALG20cells had the highest percentage of pDNA (41% vs 31% and 26%for MG1655endArecA and DH5, respectively). The distribu-tion of plasmid topoisomers and the presence of impurities likeRNA, gDNA, and residual proteins in the final pDNA were alsoinvestigated (Table 2 and Fig. 3). An agarose gel electrophoresisanalysis with ethidium bromide staining showed that RNA impu-rities were absent and that supercoiled isoforms predominate inthe three pDNA preparations (Fig. 3). The levels of protein con-tamination were residual and independent of the starting cells.Although low amounts of gDNA were detected in samples iso-lated from GALG20 and MG1655endArecA cells, gDNA contentin pDNA preparations derived from DH5 was higher than the rec-ommended value (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.3. ผลกระทบของลักษณะทางพันธุกรรมต้องใช้บน pDNA purificationWhile หลากหลายต้องใช้ผลิตโดยตรงมีผลต่อผลตอบแทน pDNAfermentation มันอาจส่งผลกระทบต่อ pDNA ฟอกเป็น aresult ของการเปลี่ยนแปลงทางอัตราส่วนระหว่าง plasmid และสิ่งสกปรกก่อนหน้านี้เป็นสรุป ต้องใช้วิศวกรรมสามารถเพิ่มต่อ centage การ pDNA ต่อเซลล์ ลดสิ่งสกปรกดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ genomic, anddecrease กระบวนการกระแส หรือความหนืด lysate (Bower และ Prather, 2009) นอกจากนี้ ต้องใช้อย่างระมัดระวังมาอาจทำในโทโพโลยี improvedplasmid improvedplasmid segregational เสถียรภาพ และในที่สุดคอนส่วยการ transfection ที่เพิ่มประสิทธิภาพของ plasmidproduct สุดท้าย (Gonc¸ alves et al., 2012) การทดลองที่อธิบายไว้ใน thissection ถูกออกแบบมาเพื่อประเมินผลกระทบของลักษณะทางพันธุกรรมต้องใช้ในการฟอกและคุณภาพสุดท้ายของ pDNA Fermentationswere เฟดชุดแรกทำกับสายพันธุ์สามใช้กลยุทธ์ดึงกำลังเดียวกันและเงื่อนไข (ดูส่วน 2) Plasmid DNA ถูก thenpurified จากชีวมวล harvested ที่ใช้กระบวนการที่ฝน combinesalkaline lysis, isopropanol และแอมโมเนียซัลเฟต โต้ตอบ hydrophobic chromatography (ชไอ) และแยกขนาด (ดัดแปลงจาก Diogo et al., 2000)สุภัคจำนวนความแตกต่างระหว่างเงื่อนไข strainsin สามกระบวนการผลผลิตและคุณภาพของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (ตาราง 2) AnHPLC วิเคราะห์แสดงให้เห็นว่า ได้รับจาก GALG20cells lysates ใสมีเปอร์เซ็นต์สูงสุดของ pDNA (41% เทียบกับ 26% MG1655 endA recA และ DH5 และ 31% ตามลำดับ) Distribu-สเตรชันของ plasmid topoisomers และ likeRNA สิ่งสกปรก gDNA และโปรตีนตกค้างใน pDNA สุดท้ายก็ถูก alsoinvestigated (ตารางที่ 2 และ Fig. 3) Electrophoresisanalysis เป็นเจ agarose กับย้อมสีโบรไมด์ ethidium พบว่า อาร์เอ็นเอ impu-rities ได้ขาด และที่ supercoiled isoforms predominate เตรียม pDNA 3 (Fig. 3) ระดับของโปรตีนคอน tamination เหลือ และขึ้นอยู่กับเซลล์เริ่มต้นแม้ gDNA จำนวนต่ำสุดที่ตรวจพบในตัวอย่าง iso lated จาก GALG20 และ MG1655 เซลล์ recA endA, gDNA contentin เตรียม pDNA มาจาก DH5 ได้สูงกว่าค่า rec ommended (< 10 ng gDNA / g pDNA) (CBER/FDA, 2007 Diogoet al., 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.3 ผลกระทบของลักษณะทางพันธุกรรมความเครียดใน pDNA purificationWhile ทางเลือกของสายพันธุ์ที่มีผลกระทบต่อการผลิตโดยตรงผลผลิต pDNAfermentation ก็อาจส่งผลกระทบต่อการทำให้บริสุทธิ์ pDNA เช่นเดียวกับ aresult ของการเปลี่ยนแปลงในอัตราส่วนระหว่างพลาสมิดและ impurities.As การตรวจสอบก่อนหน้านี้ทางวิศวกรรมความเครียดสามารถเพิ่ม pDNA ต่อ Centage ต่อ เซลล์ลดดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและสิ่งสกปรกกระแสกระบวนการ anddecrease หรือความหนืด lysate (ซุ้มและ Prather 2009) นอกจากนี้สายพันธุ์ที่ได้รับการออกแบบอย่างระมัดระวังอาจทำให้ improvedplasmid โครงสร้าง improvedplasmid และความมั่นคง segregational และในที่สุดก็ Con-ส่วยให้ประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้นของ transfection plasmidproduct สุดท้าย (Gönç alves et al., 2012) การทดลองที่อธิบายไว้ใน thissection ถูกออกแบบมาเพื่อประเมินผลกระทบของการตรวจหาสายพันธุ์สายพันธุ์ onthe บริสุทธิ์และคุณภาพสุดท้ายของ pDNA เฟดชุด fermentationswere ครั้งแรกกับสามสายพันธุ์โดยใช้กลยุทธ์ feed-ing เดียวกันและเงื่อนไข (ดูมาตรา 2) ดีเอ็นเอถูก thenpurified จากชีวมวลเก็บเกี่ยวโดยใช้กระบวนการที่ combinesalkaline สลาย isopropanol และแอมโมเนียมซัลเฟตตกตะกอน, โคปฏิสัมพันธ์ชอบน้ำ (HIC) และการยกเว้นขนาด (ดัดแปลงมาจาก Diogo et al., 2000) ในขณะนี้ A จำนวนของความแตกต่างถูกตั้งข้อสังเกตในสาม เงื่อนไข strainsin ผลผลิตกระบวนการและคุณภาพของผลิตภัณฑ์สุดท้าย (ตารางที่ 2) การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่า AnHPLC ชี้แจง lysates ที่ได้รับจาก GALG20cells มีเปอร์เซ็นต์สูงสุดของ pDNA (41% เทียบกับ 31% และ 26% สำหรับ MG1655? Enda? recA และ DH5 ?, ตามลำดับ) distribu-การของ topoisomers พลาสมิดและการปรากฏตัวของสิ่งสกปรก likeRNA, gDNA และโปรตีนที่เหลือใน pDNA สุดท้ายถูก alsoinvestigated (ตารางที่ 2 และรูปที่. 3) electrophoresisanalysis เจล agarose กับการย้อมสีโบรไมด์ ethidium แสดงให้เห็นว่าอาร์เอ็นเอ impu rities-ขาดและไอโซฟอร์ม supercoiled ครอบงำ inthe สามเตรียม pDNA (รูปที่. 3) ระดับของโปรตีน Con-tamination มีเหลือและเป็นอิสระจากจำนวนเงินที่ต่ำ cells.Although เริ่มต้นของ gDNA ถูกตรวจพบในตัวอย่าง iso-lated จาก GALG20 และ MG1655? Enda? เซลล์ recA และ gDNA contentin เตรียม pDNA มาจาก DH5? สูงกว่ามูลค่าที่ REC ommended (<10 ศึกษา gDNA / กรัม pDNA?) (CBER / FDA, 2007. Diogoet อัล, 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.3 . ผลกระทบของความเครียดใน pdna purificationwhile กับทางเลือกของการผลิตความเครียดมีผลโดยตรงต่อ pdnafermentation ผลผลิต อาจส่งผลต่อ pdna บำบัดน้ำเสีย รวมทั้งมีการดัดแปลงในอัตราส่วนระหว่างพลาสมิดและสิ่งสกปรก ที่ก่อนหน้านี้ดู วิศวกรรม ความเครียดสามารถเพิ่ม pdna ต่อ centage ต่อเซลล์ ลด genomic DNA และ RNA สิ่งสกปรกกระบวนการลดกระแสหรือ lysate ความหนืด ( ซุ้ม และที่ตั้ง , 2009 ) นอกจากนี้การออกแบบอย่างระมัดระวังซึ่งอาจส่งผลใน improvedplasmid improvedplasmid โครงสร้างและเสถียรภาพ segregational และในที่สุด con บรรณาการให้เพิ่มขึ้น สำหรับประสิทธิภาพของ plasmidproduct สุดท้าย ( gonc ¸ Alves et al . , 2012 )การทดลองที่อธิบายไว้ใน thissection ถูกออกแบบมาเพื่อประเมินผลกระทบต่อพันธุกรรมของสายพันธุ์บริสุทธิ์และภาพสุดท้ายของ pdna . เลี้ยงรุ่น fermentationswere แสดงครั้งแรกกับ 3 สายพันธุ์ที่ใช้เหมือนกันฟีดไอเอ็นจีกลยุทธ์และเงื่อนไข ( ส่วนที่ 2 ) พลาสมิดดีเอ็นเอ thenpurified จากเก็บเกี่ยวชีวมวลโดยใช้กระบวนการผลิตที่ combinesalkaline ,ไอโซโพรพานอล และแอมโมเนียมซัลเฟตตกตะกอน ) ปฏิสัมพันธ์ chromatography ( HIC ) และขนาดการยกเว้น ( ดัดแปลงจากดิ et al . , 2000 ) มีจำนวนของความแตกต่างที่พบระหว่างสาม strainsin แง่ของผลผลิต กระบวนการและคุณภาพของผลิตภัณฑ์สุดท้าย ( ตารางที่ 2 )การวิเคราะห์ anhplc พบว่ามี lysates ได้รับจาก galg20cells มีเปอร์เซ็นต์สูงสุดของ pdna ( ร้อยละ 41 และ 31 และ 26% สำหรับ mg1655  enda และ  รีก้าพบว่ามี  ตามลำดับ ) การ distribu tion ของพลาสมิด topoisomers และการปรากฏตัวของสิ่งสกปรก likerna gdna , และโปรตีนที่ตกค้างใน pdna สุดท้ายศึกษา ( ตารางที่ 2 และรูปที่ 3 )เป็นเจล electrophoresisanalysis bromide staining พบว่าอาร์เอ็นเอกับคู่ impu rities ขาดและที่เหนือกว่าในการเตรียม pdna supercoiled ไอโซฟอร์ม 3 ( รูปที่ 3 ) ระดับของโปรตีนคอน tamination มีที่เหลือและอิสระในเซลล์เริ่มต้น ถึงแม้ว่าปริมาณ gdna ถูกตรวจพบในตัวอย่าง ISO และสายจาก galg20 mg1655  enda  รีก้าเซลล์gdna ใน pdna การเตรียมมาจาก DH5  สูงกว่า rec ommended ค่า ( < 10 ng / g gdna  pdna ) ( cber / FDA , 2007 ; diogoet al . , 2000 )