Materials and MethodsMice and treat

Materials and Methods
Mice and treatments
Mice were housed in ‘Individually Ventilated Cages’ (IVCs)
with cedar bedding in a pathogen-free barrier facility accredited
by the Association for Assessment and Accreditation for Laboratory
Animal Care International (AAALAC). All procedures were
approved by the local Institutional Animal Care and Use
Committee (Regional Council Stuttgart, permit number: V 265/
09 EM).
In two independent experiments, we investigated 6 weeks old
female C57BL/6 mice (Janvier, Saint Berthevin Cedex, France).
The mice were divided into five groups (n= 10 per group)
according to five different dietetic regimes provided ad libitum
over eight weeks. Group 1 (controls, C) received water and mouse
breeding (MZ)-diet (standard diet from Sniff, Soest, Germany)
containing 10% (g/g) sugars. Groups 2 (fructose liquid, Fl) and 3
(sucrose liquid, Sl) received water supplemented with fructose or
sucrose at 30% (vol/vol), respectively, and enriched MZ-diet to
compensate for reduced food uptake. Groups 4 (fructose solid, Fs)
and 5 (sucrose solid, Ss) received water and the high-fructose or -
sucrose diet containing 65% (g/g) sugars, which equals the sugar
amount per day that mice ingested when offered sugar water at
30%. This approach resulted in a similar sugar uptake of about
2 g/d among all the groups except the control group (Figure 1A).
Every two weeks the mice were placed in metabolic cages for
24 h, to which they were acclimatized to before. Measuring food
and liquid intake g/d in the metabolic cages, the sugar and caloric
intake for each mouse was calculated.
After 8 weeks, the mice were weighted and anesthetized via
intra peritoneal administration (ketamine at 80 mg/kg and xylazin
at 6 mg/kg body weight). Blood was collected from the portal vein
prior to euthanatizing and plasma glucose in non-fasted mice was
measured (Laboratory analysis, Sindelfingen, Germany). Specimen
of duodenum and liver tissue were frozen immediately in
liquid nitrogen for RNA and protein extraction. Portions of liver
tissue were snap-frozen and fixed in Tissue Tek O.C.T. compound
(Sakura Finetek Europe, AV Alphen aan den Rijn, Netherlands)
for subsequent sectioning and mounting on microscope slides.
Hepatic lipid analysis
Liver tissue pieces (50–100 mg) were homogenized in ice-cold
2x PBS and lipids were extracted. Triglycerides were assessed by
chemo-luminescence using a commercial kit (Randox, Krefeld,
Germany). Values were normalized to protein concentration,
determined by Bradford assay, in liver homogenates (Bio-Rad
Laboratories, Munich, Germany).
To determine hepatic lipid accumulation, frozen sections of
liver (10 mm) were stained with Oil Red O and counterstained
with hematoxylin (Sigma, Steinheim, Germany). Representative
photomicrographs were captured at a 400x magnification using
Axio Vert 200 M (Zeiss, Jena, Germany).
Endotoxin assay
Portal plasma samples were heated at 72uC for 20 min.
Endotoxin concentration was determined using a limulus amebocyte
lysate assay kinetic kit (concentration range 0.015–1.2 EU/
mL; Charles River, Wilmington, MA). To minimize analysis
errors, samples were spiked.
RNA isolation and real-time RT-PCR
Total RNA was extracted from murine ileum or human jejunal
tissue samples using TriFast reagent (PEQLAB, Erlangen,
Germany). RNA concentrations were determined by spectrophotometry,
before 0.25 mg total RNA was reverse transcribed with
an iScript DNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Munich,
Germany) followed by a DNAse digestion step (Fermentas, St.
Leon Rot, Germany). PCR primers were designed using Primer3
software (Whitehead Institute for biomedical research, Cambridge,
MA, USA) (Table 1). SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad
Laboratories, Munich, Germany) was used to prepare the PCR
mix. The amplification reactions were carried out in an iCycler
(Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany) with 40 cycles of a
two-step PCR (denaturation 95uC for 35 s, denaturation 95uC for
5 s, annealing/extension 62uC for 10 s). The fluorescence intensity
of each sample was measured at each temperature change to
monitor amplification of the target gene. The comparative CTmethod
was used to determine the amount of target gene,
normalized to an endogenous reference gene (18S) and relative to
a calibrator (22DDCt). The purity of PCR products was verified by
melting curves and gel electrophoresis.
Human samples
Whole jejunal tissue from 20 obese (BMI = 43.166.0 kg/m2)
who underwent bariatric surgery (Roux-en-Y gastric bypass,
Hospital St. Gallen, CH) and 14 lean patients (BMI
24.863.5 kg/m2) who underwent gut surgery for different reasons
(e.g. cancer, Hospital Rechts der Isar, Munich) were analyzed. All
patients gave written informed consent to the study, which was
approved by the local ethics committees (permit number Stuttgart,
Germany: 87/2009 BO1; Munich, Germany: 1926/07; Rorschach,
Switzerland: EKSG 10/024/2B).
Calculation of metabolisable energy
The metabolisable energy is the difference between gross energy
in consumed food (determined by bomb calorimetry) and energy
in feces and urine (also measured by bomb calorimetry). The
literature shows examples of macronutrients from which the heat
of combustion and/or the coefficient of availability was measured
[24]. With this outcome one may calculate the available energy

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ
หนูและรักษา
หนูถูกแห่ง 'ทีสม่ำเสมอกรง' (IVCs)
กับเตียงซีดาร์ในสิ่งอำนวยความสะดวกฟรีการศึกษาอุปสรรคได้
โดยสมาคมประเมินและการรับรองห้องปฏิบัติการ
สัตว์ดูแลนานาชาติ (AAALAC) ขั้นตอนทั้งหมด
อนุมัติ โดยเฉพาะสถาบันสัตว์ดูแลและใช้
กรรมการ (สตุทการ์ทสภาภูมิภาค อนุญาตเลข: V 265 /
09 EM) .
ในทั้งสองการทดลองด้วยตนเอง เราสอบสวน 6 สัปดาห์
หนู C57BL/6 หญิง (Janvier, Cedex เซนต์ Berthevin ฝรั่งเศส)
หนูถูกแบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม (n = 10 สำหรับแต่ละกลุ่ม)
ตามระบอบ dietetic ต่าง ๆ ห้าให้ ad libitum
กว่าแปดสัปดาห์ กลุ่ม 1 (ควบคุม C) ได้รับน้ำและเมาส์
พันธุ์ (MZ) -อาหาร (มาตรฐานอาหารจากการสูดดม Soest เยอรมนี)
ประกอบด้วยน้ำตาล 10% (g/g) กลุ่ม 2 (ฟรักโทสเหลว Fl) และ 3
(ซูโครสเหลว Sl) รับน้ำเสริม ด้วยฟรักโทส หรือ
ซูโครส 30% (vol/vol), ตามลำดับ และอุดมไป MZ-อาหารเพื่อ
ชดเชยสำหรับดูดซับอาหารลดลง กลุ่ม 4 (ฟรักโทสทึบ Fs)
5 (ซูโครสทึบ Ss) รับและน้ำและฟรักโทสสูง หรือ -
อาหารซูโครสประกอบด้วยน้ำตาล 65% (g/g) ซึ่งเท่ากับน้ำตาล
ยอดต่อวันที่หนูกินเมื่อน้ำน้ำตาลเสนอที่
30% วิธีการนี้ทำให้เกิดการดูดซับน้ำตาลคล้ายประมาณ
2 g/d ในกลุ่มทั้งหมดยกเว้นกลุ่มควบคุม (รูปที่ 1A) .
ทุกสองสัปดาห์หนูจะถูกวางในกรงเผาผลาญสำหรับ
h 24 ซึ่งพวกเขาถูก acclimatized ให้ก่อน วัดอาหาร
g/d บริโภคน้ำในกรงเผาผลาญ และ น้ำตาลและแคลอริก
บริโภคสำหรับเมาส์แต่ละคำนวณ.
หลังจาก 8 สัปดาห์ หนูการถ่วงน้ำหนัก และด้วยผ่าน
อินทราจัดการ peritoneal (คีตามีนที่ 80 มิลลิกรัม/กิโลกรัมและ xylazin
ที่ 6 มิลลิกรัม/กิโลกรัมน้ำหนักตัว) มีการรวบรวมเลือดจากหลอดเลือดดำพอร์ทัล
ก่อน euthanatizing และพลาสม่ากลูโคสในหนูอดไม่ถูก
(ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ Sindelfingen เยอรมนี) วัด ตัวอย่าง
ของเนื้อเยื่อตับและ duodenum ถูกแช่แข็งทันทีใน
ไนโตรเจนเหลวสำหรับสกัดอาร์เอ็นเอและโปรตีน บางส่วนของตับ
ถูกเนื้อเยื่อแช่ แข็งชิด และถาวรในบริเวณเนื้อเยื่อ Tek O.C.T.
(ยุโรป Finetek ซากุระ AV อัลเฟนวิกอานเดน Rijn เนเธอร์แลนด์)
sectioning ภายหลัง และการติดตั้งบนภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์
วิเคราะห์ไขมันตับ
ชิ้นเนื้อเยื่อตับ (50 – 100 มิลลิกรัม) ถูก homogenized เป็นกลุ่มในฉ่ำ
2 x PBS และโครงการถูกสกัด ระดับไตรกลีเซอไรด์ถูกประเมินโดย
ใช้ชุดพาณิชย์ luminescence chemo (Randox, Krefeld,
เยอรมนี) ค่าได้ตามปกติเพื่อความเข้มข้นของโปรตีน,
ตามวิเคราะห์แบรดฟอร์ด ในตับ homogenates (Bio Rad
ห้องปฏิบัติการ มิวนิค เยอรมนี) .
กำหนดสะสมไขมันที่ตับ แช่แข็งส่วนของ
ตับ (10 mm) มีสี ด้วยน้ำมันแดง O และ counterstained
กับ hematoxylin (ซิก เยอรมนี Steinheim) พนักงาน
photomicrographs ถูกจับที่ 400 x ขยายใช้
Axio ออ 200 M (Zeiss, Jena เยอรมนี) .
วิเคราะห์ Endotoxin
เว็บไซต์ตัวอย่างพลาสม่ามีความร้อนที่ 72uC สำหรับ 20 นาที
Endotoxin สมาธิกำหนดใช้ limulus amebocyte
lysate ทดสอบชุดเดิม ๆ (EU ช่วง 0.015 – 1.2 ความเข้มข้น /
mL แม่น้ำชาร์ลส์ วิลมิ MA) เพื่อลดการวิเคราะห์
มี spiked ข้อผิดพลาด ตัวอย่าง.
แยกอาร์เอ็นเอและแบบเรียลไทม์ RT-PCR
รวมอาร์เอ็นเอที่สกัดจาก murine ileum หรือมนุษย์ jejunal
ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ใช้รีเอเจนต์ TriFast (PEQLAB, Erlangen,
เยอรมนี) ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอถูกกำหนด โดย spectrophotometry,
ก่อน 0.25 มิลลิกรัม อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกย้อนทับศัพท์ด้วย
การ iScript ดีเอ็นเอสังเคราะห์ชุด (ห้องปฏิบัติการชีวภาพราษฎร์ มิวนิค,
เยอรมนี) ตาม ด้วยขั้นตอนย่อยอาหาร DNAse (Fermentas, St.
Leon Rot เยอรมัน) ไพรเมอร์ PCR ถูกออกแบบโดยใช้ Primer3
ซอฟต์แวร์ (Whitehead สถาบันวิจัยทางชีวการแพทย์ เคมบริดจ์,
MA, USA) (ตารางที่ 1) SsoFast EvaGreen Supermix (Bio Rad
ห้องปฏิบัติการ มิวนิค เยอรมัน) ใช้ทำ PCR
ผสม ปฏิกิริยาขยายได้ดำเนินการ iCycler
(ห้องปฏิบัติการชีวภาพราษฎร์ มิวนิค เยอรมนี) กับรอบที่ 40 ของการ
PCR ขั้นตอนที่สอง (denaturation 95uC 35 s, 95uC denaturation สำหรับ
5 s, 62uC การอบเหนียว/ขยาย 10 s) ความเข้ม fluorescence
ของแต่ละอย่างได้ที่วัดการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิการ
ติดตามขยายยีนเป้าหมาย CTmethod เปรียบเทียบ
ถูกใช้เพื่อกำหนดจำนวนของยีนเป้าหมาย,
ตามปกติการอ้างอิง endogenous ยีน (18S) และสัมพันธ์กับ
(22DDCt) เครื่องสอบเทียบ ความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจสอบโดย
ละลายเส้นโค้งและ electrophoresis เจ.
ตัวอย่างมนุษย์
เนื้อเยื่อ jejunal ทั้ง 20 อ้วน (BMI = 43.166.0 kg/m2)
ที่รับการผ่าตัด bariatric (Roux en--Y บายพาสในกระเพาะอาหาร,
โรงพยาบาลเซนต์กัลเลน CH) 14 เมล็ดผู้ป่วยและ (BMI
24.8635 kg/m2) ที่รับการผ่าตัดลำไส้สาเหตุแตกต่างกัน
(เช่นมะเร็ง โรงพยาบาล Rechts der Isar มิวนิค) ได้วิเคราะห์ ทั้งหมด
ผู้ป่วยให้แจ้งความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรเพื่อการศึกษา ซึ่ง
ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่น (อนุญาตเลขสตุทการ์ท,
เยอรมนี: BO1 87/2009 มิวนิค เยอรมนี: 1926/07 Rorschach,
สวิตเซอร์แลนด์: 10/024/2B).
Calculation EKSG พลังงาน metabolisable
ข้อแตกต่างระหว่างพลังงานรวมคือพลังงาน metabolisable
ใช้อาหาร (กำหนด โดยระเบิด calorimetry) และพลังงาน
ในอุจจาระและปัสสาวะ (วัด โดยระเบิด calorimetry) ใน
ประกอบการแสดงตัวอย่างของรับที่ความร้อน
เผาไหม้และ/หรือค่าสัมประสิทธิ์ของความพร้อมใช้งานถูกวัด
[24] ด้วยผลนี้ หนึ่งอาจคำนวณพลังงานใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการรักษา

หนูและหนูถูกขังในกรงแบบระบายอากาศ ' ' ( ivcs )
กับซีดาร์ปรกติเชื้อโรคฟรีสิ่งกีดขวางสิ่งอำนวยความสะดวกได้รับการรับรอง
โดยสมาคมเพื่อการประเมินและรับรองดูแลสัตว์ทางห้องปฏิบัติการ
ระหว่างประเทศ ( aaalac ) ขั้นตอนทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยท้องถิ่นสถาบัน

( ใช้ดูแลสัตว์และคณะกรรมการสภาภูมิภาคสตุทการ์ทใบอนุญาตเลขที่ : V 265 /
09 เอ็ม )
2 การทดลองที่เป็นอิสระ เราได้ 6 สัปดาห์เก่า
หญิง c57bl / 6 หนู ( มกราคม , เซนต์ berthevin เซแด๊กซ์ ฝรั่งเศส ) .
หนูแบ่งออกเป็นห้ากลุ่ม ( n = 10 กลุ่ม )
ตามห้าต่างถือกันอย่างเต็มที่
กว่าแปดสัปดาห์ กลุ่มที่ 1 ( การควบคุม , C ) ได้รับน้ำและเพาะพันธุ์เมาส์
( MZ ) - อาหาร ( มาตรฐานอาหารจาก Soest , ดมเยอรมนี )
0 10 % ( g / g ) น้ำตาล กลุ่ม 2 ( ของเหลว , ฟรักโทส FL ) 3
( ของเหลว , ซูโครส SL ) ได้รับน้ำที่เติมซูโครส ฟรักโทสหรือ
ที่ 30 % ( ปริมาตร / ปริมาตร ) ตามลำดับ และอาหารที่อุดมด้วย MZ

ชดเชยการลดอาหาร . กลุ่มที่ 4 ( ฟรักโทสเป็นของ FS )
5 ( ปริมาณของแข็งแขวนลอย ) ได้รับน้ำและฟรักโทสสูง หรืออาหารที่มีซูโครสร้อยละ 65 -
( g / g ) น้ำตาลซึ่งเท่ากับปริมาณน้ำตาล
ต่อวันว่าหนูกินเมื่อเสนอน้ำตาลน้ำ
30 % วิธีการนี้มีผลในการดูดซึมน้ำตาลที่คล้ายกันเกี่ยวกับ
2 g / D ในทุกกลุ่ม ยกเว้นกลุ่มควบคุม ( รูปที่ 1A ) .
ทุก 2 สัปดาห์ หนูอยู่ในกรงสำหรับการสลาย
24 ชั่วโมง ซึ่งพวกเขาได้ปรับสภาพก่อน วัดของเหลวและการบริโภคอาหาร
g / D ในกรงสลายน้ำตาลและแคลอรี่ที่บริโภคแต่ละเมาส์หา
.
หลังจาก 8 สัปดาห์ หนูที่ถูกถ่วงน้ำหนักและยาสลบผ่านทางบริหาร ( เคตามีน
อินทรา 80 มิลลิกรัม / กิโลกรัม และ xylazin
6 มิลลิกรัมต่อน้ำหนักตัว 1 กิโลกรัม ) เก็บเลือดจากหลอดเลือด
ก่อน euthanatizing พลาสมากลูโคสอดอาหารและไม่สร้าง
วัด ( ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ Sindelfingen เยอรมนี )
ตัวอย่างเนื้อเยื่อของลำไส้และตับถูกแช่แข็งทันที
ไนโตรเจนเหลวสำหรับการสกัดอาร์เอ็นเอและโปรตีน ส่วนของเนื้อเยื่อตับ
เป็น snap แช่แข็งและคงที่ในเนื้อเยื่อเต็ก o.c.t. สารประกอบ
( ซากุระ finetek ยุโรป AV Alphen aan den Rijn , เนเธอร์แลนด์ )
ๆวุ่นและติดตั้งบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ การวิเคราะห์เนื้อเยื่อตับตับไขมัน

ชิ้น ( 50 - 100 มิลลิกรัม ) ถูกบดในเย็น
2x PBS และไขมันสกัด . กิจกรรมประเมินได้จากการใช้เครื่องมือเชิงพาณิชย์ด้วย
( randox Krefeld เยอรมนี , ,
) ค่าปกติกับความเข้มข้นโปรตีน
กำหนดโดย Bradford assay ใน homogenates ตับ ( ไบโอ ราด
ห้องปฏิบัติการ , มิวนิก , เยอรมนี ) .
หาไขมันสะสมตับแช่แข็ง ส่วน
ตับ ( 10 มม. ) ถูกย้อมด้วยสีแดงและน้ำมัน counterstained
oกับย้อม ( Sigma , steinheim , เยอรมัน ) ตัวแทน
photomicrographs ถูกจับที่ 400x ขยายโดยใช้
โรล่า แอกซิโอสีเขียว 200 เมตร ( Zeiss Jena , เยอรมนี )
3
รเ โดท็ ซินพอร์ทัลพลาสมาจำนวนความร้อนที่ 72uc 20 นาที
รเ โดท็ ซินความเข้มข้นตั้งใจใช้ limulus amebocyte
lysate assay จาก Kit ( ช่วง 3 ) ความเข้มข้น 1.2 สหภาพยุโรป /
มิลลิลิตร ; ชาร์ลส์ ริเวอร์ วิลมิงตัน , MA )เพื่อลดจำนวนข้อผิดพลาดการวิเคราะห์
, C .

ทั้งหมดนี้แยก RNA และเรียลไทม์ซึ่งสกัดจาก ~
jejunal ลำไส้หรือเนื้อเยื่อมนุษย์ตัวอย่าง โดยใช้ trifast Reagent ( peqlab Erlangen เยอรมนี , ,
) ซึ่งถูกกำหนดโดยวิธีที่ความเข้มข้น 0.25 มิลลิกรัม , รวม RNA คือ
ก่อนกลับถ่ายทอดด้วย
iscript ดีเอ็นเอสังเคราะห์เป็นชุด ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , มิวนิค ,
เยอรมนี ) ตามด้วยการตรวจหา ADNase การย่อยอาหารขั้น ( fermentas St .
ลีออนเน่า , เยอรมัน ) PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ primer3
( สิวที่สถาบันเพื่อการวิจัยทางการแพทย์ :
, MA , USA ) ( ตารางที่ 1 ) ssofast evagreen supermix ( ไบโอ ราด
ห้องปฏิบัติการ , มิวนิก , เยอรมนี ) ถูกใช้เพื่อเตรียมการตรวจ
ผสม โดยการเพิ่มปฏิกิริยา พบว่าใน icycler
( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , มิวนิคเยอรมนี ) กับ 40 รอบของ PCR (
2 ( 95uc 35 s ( 95uc สำหรับ
5 S , การอบ / นามสกุล 62uc 10 วินาที ) เรืองแสงเข้ม
ของแต่ละตัวอย่างถูกวัดที่อุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงในแต่ละจอภาพแบบ

ของยีนเป้าหมาย
ctmethod เปรียบเทียบที่ใช้หาปริมาณของยีนเป้าหมาย
ปกติเป็นยีนอ้างอิงภายนอก ( 18S ) และเทียบกับการคาลิเบรเตอร์ ( 22ddct ) ความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจสอบความถูกต้องโดย
ละลาย โค้ง และ เจล

ทั้ง jejunal ตัวอย่างเนื้อเยื่อจาก 20 คนอ้วน ( BMI = 43.166.0 kg / m2 )
ที่เข้ารับการผ่าตัด bariatric ( roux-en-y gastric bypass
โรงพยาบาลเซนต์กัลเลน , CH ) และ 14 ราย ยัน ( BMI
24.863 .5 kg / m2 ) ที่เข้ารับการผ่าตัดไส้หลากหลายเหตุผล
( มะเร็ง เช่น โรงพยาบาล rechts der ISAR มิวนิค ) มาวิเคราะห์ ผู้ป่วย
ให้เขียนความยินยอมกับการศึกษา ซึ่งได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรม
ท้องถิ่น ( ใบอนุญาตเลขที่สตุทการ์ท เยอรมนี : 87 / 2552 bo1
; มิวนิค , เยอรมนี : 1926 / 07 ; ,
, สวิตเซอร์แลนด์ : eksg 10 / 024 / 2B )

metabolisable การคำนวณพลังงานพลังงาน metabolisable คือความแตกต่างระหว่าง
พลังงานรวมในบริโภคอาหาร ( กำหนดโดยอุปกรณ์ควบคุมระเบิด ) และพลังงาน
ในอุจจาระและปัสสาวะ ( วัดโดยอุปกรณ์ควบคุมระเบิด )
วรรณกรรมแสดงให้เห็นตัวอย่างของธาตุอาหาร ซึ่งความร้อน
ของการเผาไหม้และ / หรือค่าห้องพักวัด
[ 24 ] กับผลนี้จะคำนวณพลังงานที่ใช้ได้