Real Time PCR (RT-PCR) was performe

Real Time PCR (RT-PCR) was performed in a Light-Cycler
amplifier (Light-Cycler, Roche, Germany) using a FRET
detection system. Template DNA was amplified in a total reaction
volume of 15 μl. The RT-PCR mixture comprised 1× PCR
buffer (200 mM Tris–HCl pH 8.4, 500 mM KCl) 4 mM MgCl2,
0.2 mM each dNTPs, 10 pmol of each primer, 4 pmol of each
labelled probe and 1U of Platinum high fidelity Taq polymerase
(Invitrogen, California USA). The amplification profile initiated
by a 2 min incubation at 94 °C, followed by 40 cycles at 94 °C
for 10 s, annealing temperature and time differing among
species (Table 1), 72 °C for 15 s. Serial dilutions of DNA from
heat treated and untreated meat were amplified to construct the
standard curve for each target species. The Ct (crossing
threshold) values, defined as the number of cycles needed to
reach a defined relative fluorescence level (calculated by the
Roche Light-Cycler Software 4.0), were plotted as a linear
function of the Log of DNA concentration. A melting curve was
plotted at the end of each run, to verify the specificity of the
amplification product. For each experiment, the reaction
efficiency for standard and sample curves was measured as
described in the Roche Light-Cycler manual. Following Real
Time PCR, products were also electrophoresed in a 2% agarose
gel and visualized by ethidium bromide staining.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำในแสง-Cycler Real Time PCR (RT-PCR)เพาเวอร์แอมป์ (แสง-Cycler, Roche เยอรมนี) โดยใช้ความไม่สบายใจระบบตรวจสอบ ดีเอ็นเอแม่แบบถูกขยายในปฏิกิริยารวมปริมาณของ 15 μl RT-PCR ส่วนผสมประกอบด้วย 1 การ PCRบัฟเฟอร์ (200 mM ตรี – HCl pH 8.4, 500 mM KCl) MgCl2, 4 มม.0.2 mM dNTPs, 10 pmol แต่ละพื้น pmol 4 ของแต่ละมันโพรบและ 1U ของพอลิเมอเรส Taq แพลทินัมสูงความจงรักภักดี(Invitrogen แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) ขยายส่วนกำหนดค่าเริ่มต้นโดยบ่ม 2 นาทีที่ 94 ° C ตามรอบ 40 ที่ 94 ° Cสำหรับ 10 s หลอมอุณหภูมิ และเวลาที่แตกต่างกันระหว่างชนิด (ตาราง 1), 72 ° C 15 s. dilutions ลำดับของดีเอ็นเอจากเนื้อไม่ถูกรักษา และบำบัดถูกขยายเพื่อสร้างความร้อนเส้นมาตรฐานสำหรับแต่ละชนิดเป้าหมาย Ct (ข้ามค่าขีดจำกัด) กำหนดเป็นจำนวนรอบที่จำเป็นในการถึงระดับกำหนดญาติ fluorescence (คำนวณโดยการ4.0 ซอแสง Cycler Roche), ถูกพล็อตเป็นแบบเชิงเส้นหน้าที่ของสมาธิบันทึกดีเอ็นเอ เส้นโค้งที่ละลายได้ลงจุดที่สิ้นสุดของแต่ละรัน specificity ของการตรวจสอบการขยายผลิตภัณฑ์ สำหรับแต่ละการทดลอง ปฏิกิริยาเป็นวัดประสิทธิภาพสำหรับเส้นโค้งมาตรฐาน และชิ้นงานตัวอย่างเป็นอธิบายไว้ในคู่มือ Roche แสง Cycler ต่อไปนี้จริงเวลา PCR ผลิตภัณฑ์ยังถูก electrophoresed ใน agarose 2%เจ และ visualized โดยย้อมสีโบรไมด์ ethidium

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR แบบ Real Time (RT-PCR) ได้ดำเนินการในแสง Cycler
เครื่องขยายเสียง (แสง Cycler, Roche, เยอรมนี) ฉลุโดยใช้
ระบบการตรวจสอบ ดีเอ็นเอแม่แบบถูกขยายในปฏิกิริยารวม
ปริมาณ 15 ไมโครลิตร ส่วนผสม RT-PCR ประกอบด้วย 1 × PCR
บัฟเฟอร์ (200 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 8.4, 500 มิลลิ KCl) 4 มิลลิ MgCl2,
0.2 มิลลิแต่ละ dNTPs 10 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ 4 pmol ของแต่ละ
หัววัดที่มีข้อความและ 1U ของความจงรักภักดีสูงแพลทินัม โพลิเมอร์ Taq
(Invitrogen แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) รายละเอียดการขยายริเริ่ม
โดย 2 นาทีบ่มที่ 94 องศาเซลเซียสตามด้วย 40 รอบที่ 94 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 10 วินาที, อุณหภูมิการหลอมและเวลาที่แตกต่างกันในหมู่
สายพันธุ์ (ตารางที่ 1) 72 ° C เป็นเวลา 15 วินาที เจือจางอนุกรมของดีเอ็นเอจาก
ความร้อนได้รับการรักษาและเนื้อสัตว์ได้รับการรักษาที่ถูกขยายเพื่อสร้าง
กราฟมาตรฐานสำหรับแต่ละชนิดเป้าหมาย กะรัต (ข้าม
ธรณีประตู) ค่าที่กำหนดไว้จำนวนรอบที่จำเป็นในการ
เข้าถึงผู้กำหนดระดับการเรืองแสงญาติ (คำนวณโดย
โรชแสง Cycler ซอฟแวร์ 4.0) ถูกพล็อตเป็นเชิงเส้น
ของฟังก์ชั่นเข้าสู่ระบบของความเข้มข้นของดีเอ็นเอ โค้งละลายถูก
พล็อตในตอนท้ายของการทำงานแต่ละที่จะตรวจสอบความจำเพาะของ
สินค้าขยาย สำหรับการทดสอบแต่ละปฏิกิริยา
ที่มีประสิทธิภาพสำหรับเส้นโค้งมาตรฐานและตัวอย่างวัดเป็น
ที่อธิบายไว้ในคู่มือ Roche แสง Cycler ต่อไปนี้จริง
PCR เวลาผลิตภัณฑ์ยัง electrophoresed ใน agarose 2%
เจลและมองเห็นโดยการย้อมสี ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เรียลไทม์ พีซี ร์ ( RT-PCR ) แสดงในแสง ( แสงวงจรเครื่องขยายเสียงวงจร
, โรช , เยอรมนี ) โดยใช้ระบบตรวจจับแบบหงุดหงิด

ดีเอ็นเอแม่แบบถูกขยายในปริมาตรปฏิกิริยา
รวม 15 ลิตร ส่วนผสมประกอบด้วย กันชนμ RT-PCR )
1 × ( 200 มม. นอกจากนี้ – HCl pH 8.4 , 500 mm . ) ชุด 4 มม.
0.2 มม. แต่ละ dntps 10 pmol ของแต่ละคู่แต่ละ
4 pmolชื่อวิด probe และแพลทินัมความจงรักภักดีสูงได้ดีโดย
( Invitrogen รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) โดยการเพิ่มโปรไฟล์เริ่มต้น
โดย 2 นาทีบ่มที่ 94 ° C ตามด้วย 40 รอบที่ 94 ° C
10 S , การอบอุณหภูมิและเวลาที่ต่างกันระหว่าง
ชนิด ( ตารางที่ 1 ) , 72 ° C เป็นเวลา 15 วินาที ซีเรียลเจือจางของดีเอ็นเอจากความร้อนได้รับการรักษาและเนื้อดิบ

ถูกขยายเพื่อสร้างมาตรฐานเส้นโค้งสำหรับเป้าหมายแต่ละชนิด CT ( ข้ามธรณีประตูค่า
) หมายถึง จำนวนรอบต้องการ

ถึงญาติ ( คำนวณโดยการกำหนดระดับ
โรช รอบเบาซอฟต์แวร์ 4.0 ) , พล็อตเป็นฟังก์ชันเชิงเส้น
ของบันทึกของความเข้มข้น ดีเอ็นเอ หลอมลักษณะ
วางแผนในตอนท้ายของแต่ละคนวิ่ง เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของผลิตภัณฑ์
( .ในแต่ละการทดลอง ปฏิกิริยา
ประสิทธิภาพมาตรฐาน และตัวอย่างถูกวัดเป็นเส้นโค้ง
อธิบายในโรชแสงวงจรคู่มือ ต่อไปนี้ PCR
เวลาจริง , ผลิตภัณฑ์ยัง electrophoresed ในเจล (
2 % และการมองเห็นโดยคู่ bromide staining