3 DiscussionAs previously indicated

3 Discussion
As previously indicated, the two important criteria for estimating
a DNA barcode are suitable intra- and inter-specific
sequence variation and high success rate of PCR amplification
and sequencing. In our study, the success rates of PCR
amplification and sequencing for all tested markers were
more or less the same because of the new primer pairs introduced.
Therefore, a suitable intra- and inter-specific sequence
variation becomes critical. Our results suggest that
the combination of partial EF-1α and RPB2 genes may
serve as the DNA barcode for the genus Neonectria.
As a qualified DNA barcode, a short, single DNA fragment
should be distinct enough to separate a wide range of
species. The fact that fungi display extremely high species
diversity among living organisms may cause problems
during determination of a universal barcode. In the case of
Neonectria, when a single DNA fragment is considered as a
barcode marker, the EF-1α and RPB2 genes were both better
than the ITS and β-tubulin genes. The EF-1α gene possessed
more or less adequate intra- and inter-specific variations,
and therefore had the highest species identification
power among the candidate markers. It is able to recognize
17 of the 19 species tested (89.5%, Table 2), with the exception
of the two closely related species. RPB2 gene ranks the
next (16/19, 84.2%, Table 2). This result conforms to the
previous studies in certain other fungal groups [38,52–54].
The other two genes, β-tubulin and ITS, had undesirable intra-
and inter-variations and exhibited relatively poor species
resolution capacity (Table 2), which indicated that the
partial β-tubulin gene and ITS gene are inadequate to identify
closely related species. The low inter-specific variation
in ITS failed to discriminate closely related species (Figure
1), which was also reported in other groups of fungi [55–57]
and thus limits its application as a DNA barcode [20].
A two-locus DNA barcode, the combination of plasmid
genes rbcL and matK, was adopted recently as the main
barcode of land plants [58]. In our case, no single gene
could serve as a powerful DNA barcode. We thus proposed
to use two gene fragments instead one as the barcode for the
group. The combination of the EF-1α and RPB2 genes recognized
all species of the genus (Figure 1; 19/19, 100%,
Table 2). This is because the three species (N. confusa, Nectria
faginata and N. punicea) that the RPB2 gene failed to
identify can easily be separated by the EF-1α gene. Similarly,
the two species (N. ditissima and N. major) that the EF-1α
gene was unable to distinguish are well-differentiated by the
RPB2 gene. These two gene fragments appear to be complementary
and work jointly as the DNA barcode of
Neonectria.
During our screening of the DNA barcode, attention was
also paid to the establishment of the correct species concepts
for this group of fungi. The neighbor-joining tree generated
by combined sequences of the EF-1α and RPB2
genes indicates that collections formerly treated as N. ditissima
(as Nectria galligena) and N. confusa were not completely
identical in DNA sequences, although their morphological
distinctions were relatively few or negligible at
the species level. The sequence analysis and inter- and intra-
specific variations displayed by these collections led to
the discovery of two cryptic species, N. ditissimopsis and N.
microconidia (Figures 1–5). The former was previously
merged with N. ditissima [30], and the latter was treated as
an intra-specific variant of N. confusa, based on morphological
and culture characteristics [32].Our sequence analysis
also revealed that N. ditissimopsis is closely related to N.
ditissima, N. major, and Nectria neomacrospora, with
100% bootstrap value, which is in accordance with their
morphological similarity. Neonectria microconidia is
closely related to N. confusa, N. coccinea, N. punicea, and
N. faginata, also with 100% bootstrap support. Detailed
morphological comparisons between N. microconidia and N.
confusa have already been discussed.
DNA barcoding is becoming a helpful tool in the assessment
of biodiversity. Discovery of cryptic species by
DNA barcoding has been reported in butterfly [59] and yew
[60]. The current work suggests that integrated studies on
morphology and DNA sequence data have a bright future in
the exploration of fungal diversity and the establishment of
clear species concepts.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3
การอภิปรายตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ทั้งสองเงื่อนไขที่สำคัญสำหรับการประเมินบาร์โค้ดดีเอ็นเอเป็น
intra-
เหมาะสมและระหว่างที่เฉพาะเจาะจงรูปแบบลำดับและอัตราความสำเร็จสูงในการขยายPCR
และการเรียงลำดับ ในการศึกษาของเราอัตราความสำเร็จของ PCR ขยายและลำดับสำหรับเครื่องหมายการทดสอบทุกคนมากหรือน้อยเหมือนกันเพราะของไพรเมอร์คู่ใหม่ที่นำมา. ดังนั้น intra- และลำดับระหว่างที่เฉพาะเจาะจงที่เหมาะสมการเปลี่ยนแปลงกลายเป็นสิ่งสำคัญ ผลของเราแสดงให้เห็นว่าการรวมกันของบางส่วน EF-1αและยีน RPB2 อาจทำหน้าที่เป็นดีเอ็นเอบาร์โค้ดสำหรับประเภท Neonectria ได้. ในฐานะที่เป็นดีเอ็นเอบาร์โค้ดที่มีคุณภาพสั้นชิ้นดีเอ็นเอเดียวควรจะแตกต่างกันมากพอที่จะแยกความหลากหลายของสายพันธุ์ ความจริงที่ว่าจอแสดงผลเชื้อราสายพันธุ์สูงมากมีความหลากหลายในหมู่สิ่งมีชีวิตอาจทำให้เกิดปัญหาในระหว่างการตัดสินใจของบาร์โค้ดสากล ในกรณีที่Neonectria เมื่อชิ้นดีเอ็นเอเดียวถือเป็นเครื่องหมายบาร์โค้ด, EF-1αและยีน RPB2 ทั้งสองดีขึ้นกว่าITS และยีนβ-tubulin ยีน EF-1αมีintra- มากขึ้นหรือน้อยลงและเพียงพอระหว่างรูปแบบที่เฉพาะเจาะจงและดังนั้นจึงมีการระบุสายพันธุ์ที่สูงที่สุดอำนาจในหมู่ผู้สมัครเครื่องหมาย มันสามารถที่จะรับรู้ถึง17 จาก 19 สายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบ (89.5% ตารางที่ 2) โดยมีข้อยกเว้นของทั้งสองสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด ยีน RPB2 อันดับถัดไป(16/19, 84.2% ตารางที่ 2) ผลที่ได้นี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ในบางกลุ่มเชื้อราอื่น ๆ [38,52-54]. อีกสองยีนβ-tubulin และ ITS มี intra- ที่ไม่พึงประสงค์และรูปแบบระหว่างการจัดแสดงและสายพันธุ์ที่ค่อนข้างยากจนความจุความละเอียด(ตารางที่ 2) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าบางส่วนของยีนβ-tubulin และยีนอยมีไม่เพียงพอที่จะระบุสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด การเปลี่ยนแปลงระหว่างที่เฉพาะเจาะจงต่ำใน ITS ล้มเหลวในการแยกแยะสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด (รูปที่ 1) ซึ่งได้รับการรายงานในกลุ่มอื่น ๆ ของเชื้อรา [55-57] และทำให้ จำกัด การประยุกต์ใช้บาร์โค้ดเป็นดีเอ็นเอ [20]. สอง-สถานที่ บาร์โค้ดดีเอ็นเอการรวมกันของพลาสมิดยีนrbcL และ MATK เป็นลูกบุญธรรมเมื่อเร็ว ๆ นี้เป็นหลักบาร์โค้ดของพืชบก[58] ในกรณีของเราไม่มียีนเดียวสามารถใช้เป็นบาร์โค้ดดีเอ็นเอที่มีประสิทธิภาพ เราจึงเสนอที่จะใช้สองชิ้นยีนแทนหนึ่งเป็นบาร์โค้ดสำหรับที่กลุ่ม การรวมกันของ EF-1αและยีน RPB2 ได้รับการยอมรับทุกชนิดของพืชและสัตว์(รูปที่ 1; 19/19, 100% ตารางที่ 2) เพราะนี่คือสามชนิด (เอ็น confusa, Nectria faginata และเอ็น punicea) ที่ยีน RPB2 ล้มเหลวที่จะระบุได้อย่างง่ายดายสามารถแยกจากกันโดยยีนEF-1α ในทำนองเดียวกันทั้งสองชนิด (เอ็นเอ็น ditissima และที่สำคัญ) ที่ EF-1αยีนก็ไม่สามารถแยกแยะความแตกต่างเป็นอย่างดีโดยมีความแตกต่างของยีนRPB2 ทั้งสองชิ้นส่วนของยีนที่ดูเหมือนจะเป็นที่สมบูรณ์และการทำงานร่วมกันเป็นดีเอ็นเอบาร์โค้ดของNeonectria. ในระหว่างการตรวจคัดกรองของดีเอ็นเอบาร์โค้ดให้ความสนใจได้จ่ายให้แก่สถานประกอบการนอกจากนี้ยังมีแนวคิดสายพันธุ์ที่ถูกต้องสำหรับกลุ่มของเชื้อรานี้ เพื่อนบ้านเข้าสู่ต้นไม้ที่สร้างขึ้นโดยลำดับรวมของ EF-1αและ RPB2 ยีนบ่งชี้ว่าคอลเลกชันได้รับการรักษาก่อนที่เอ็น ditissima (ตามที่ Nectria galligena) และเอ็น confusa ไม่สมบูรณ์เหมือนกันในลำดับดีเอ็นเอแม้ว่าลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพวกเขาแตกต่างมีค่อนข้างน้อยหรือเล็กน้อยที่ระดับสายพันธุ์ การวิเคราะห์ลำดับและระหว่าง intra- และรูปแบบที่เฉพาะเจาะจงแสดงโดยคอลเลกชันเหล่านี้นำไปสู่การค้นพบของทั้งสองสายพันธุ์ที่เป็นความลับของเอ็นและเอ็นditissimopsis microconidia (รูปที่ 1-5) อดีตที่ได้รับก่อนหน้านี้รวมกับ ditissima เอ็น [30] และหลังได้รับการรักษาเป็นตัวแปรภายในที่เฉพาะเจาะจงของconfusa เอ็นขึ้นอยู่กับลักษณะทางสัณฐานวิทยาลักษณะและวัฒนธรรม[32] การวิเคราะห์ลำดับเรายังพบว่าditissimopsis N. คืออย่างใกล้ชิด ที่เกี่ยวข้องกับเอ็นditissima เอ็นที่สำคัญและ Nectria neomacrospora มีค่าบูต100% ซึ่งเป็นไปตามของพวกเขาคล้ายคลึงกันทางสัณฐานวิทยา Neonectria microconidia จะเกี่ยวข้องกับเอ็นconfusa เอ็นชิเนียเอ็น punicea และเอ็น faginata ยังมี 100% สนับสนุนบูต รายละเอียดของการเปรียบเทียบระหว่างก้านเอ็นเอ็นและ microconidia confusa ได้รับการกล่าวถึง. บาร์โค้ดดีเอ็นเอจะกลายเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพ การค้นพบสายพันธุ์ที่เป็นความลับโดยบาร์โค้ดดีเอ็นเอที่ได้รับรายงานในผีเสื้อ [59] และต้นยู [60] การทำงานในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าการศึกษาแบบบูรณาการในลักษณะทางสัณฐานวิทยาและข้อมูลลำดับดีเอ็นเอมีอนาคตที่สดใสในการสำรวจความหลากหลายของเชื้อราและการจัดตั้งที่ชัดเจนแนวคิดสายพันธุ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 สนทนา
ก่อนหน้านี้ระบุ สำคัญสองเกณฑ์การประเมิน : ดีเอ็นเอบาร์โค้ดที่เหมาะสมภายในและระหว่างการเปลี่ยนแปลงลำดับเฉพาะเจาะจง และอัตราความสำเร็จสูง

) และเพิ่มจำนวนของ ในการศึกษาของเรา ความสำเร็จของการขยาย PCR
เทคและการทดสอบทั้งหมดเครื่องหมายถูก
เพิ่มเติม หรือเหมือนกัน เพราะของใหม่ ไพรเมอร์คู่แนะนำ
จึงน้อยลงเป็นภายในที่เหมาะสม และ อินเตอร์ การเปลี่ยนแปลงลำดับ
เฉพาะจะกลายเป็นวิกฤติ จากผลการศึกษาว่า การรวมกันของα
ef-1 บางส่วนและ rpb2 ยีนอาจ
เป็นบาร์โค้ด DNA สำหรับสกุล neonectria .
มีคุณสมบัติเป็นดีเอ็นเอบาร์โค้ด , สั้น ๆ ,
ชิ้นส่วนดีเอ็นเอเดียวควรชัดเจนพอที่จะแยกหลากหลาย
ชนิด ความจริงที่ว่าเชื้อราชนิด
แสดงสูงมากความหลากหลายของสิ่งมีชีวิต อาจทำให้เกิดปัญหาในการหา
บาร์โค้ดสากล ในกรณีของ
neonectria เมื่อชิ้นส่วนดีเอ็นเอเดียวถือเป็น
บาร์โค้ดเครื่องหมาย , และ ef-1 α rpb2 ยีนทั้งคู่ดีกว่า
กว่า และบีตา - ทิวบูลินยีน ยีนα ef-1 สิง
มากขึ้นหรือน้อยลงเพียงพอภายในและระหว่างรูปแบบเฉพาะ
และดังนั้นจึงมีค่าชนิดตัว
พลังในหมู่ผู้สมัครเครื่องหมาย มันสามารถจำ
17 19 ชนิด ทดสอบ ( ลดลง ( ตารางที่ 2 ) ด้วยข้อยกเว้น
ของทั้งสองที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดชนิด ยีน rpb2 อันดับ
ต่อไป ( 16 / 19 , 84.2 ( ตารางที่ 2 ) ผลที่ได้นี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ในบางอื่น ๆ
38,52 –เชื้อรากลุ่ม [ 54 ] .
อีกสองยีนบีตา - ทิวบูลิน และของไม่พึงประสงค์ภายในได้ -
Inter และรูปแบบและมีความละเอียดค่อนข้างยากจนชนิด
ความจุ ( ตารางที่ 2 ) ซึ่งพบว่าบางส่วนของยีนบีตา -
ทูบูลินและยีนที่มีไม่เพียงพอที่จะระบุ
ชนิดที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด . ระดับอินเตอร์
รูปแบบเฉพาะในของมันล้มเหลวในการจำแนกชนิดที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด ( รูป
1 ) ซึ่งมีกลุ่มอื่น ๆของเชื้อรา [ 57 ]
55 จำกัดและดังนั้นจึง จำกัด การประยุกต์ใช้บาร์โค้ดดีเอ็นเอเป็น [ 20 ] .
2 - ดีเอ็นเอบาร์โค้ด , การรวมกันของ rbcl
ยีนที่พลาสมิด และ matk ถูกประกาศใช้เมื่อเร็ว ๆนี้เป็นบาร์โค้ดหลัก
ของพืช [ 58 ] ที่ดิน ในกรณีนี้ ไม่มียีน
สามารถใช้เป็นบาร์โค้ดดีเอ็นเอที่มีประสิทธิภาพ เราจึงเสนอให้ใช้ชิ้นส่วนแทน
2 ยีนหนึ่งเป็นบาร์โค้ดสำหรับ
กลุ่ม การรวมกันของα ef-1 rpb2 รู้จัก
และยีนทั้งหมดชนิดของพืชสกุล ( รูปที่ 1 ; 19 / 19 , 100 %
2 โต๊ะ ) นี้เป็นเพราะทั้ง 3 ชนิด ( N . confusa nectria faginata และ N ,
punicea ) ที่ rpb2 ยีนล้มเหลว
ระบุได้อย่างง่ายดายสามารถแยกยีนα ef-1 . เหมือนกับ ,
2 ชนิด ( น. ditissima และเอ็นสาขา ) ซึ่งยีนα
ef-1 ไม่สามารถที่จะแยกแยะความแตกต่างโดยดี
rpb2 ยีนเหล่านี้สองยีนเศษที่ปรากฏจะทำงานร่วมกันเป็นคู่

neonectria ดีเอ็นเอบาร์โค้ดของ .
ในระหว่างคัดกรองของบาร์โค้ดดีเอ็นเอ ความสนใจ
ยังจ่ายให้สถานประกอบการของแนวคิด
ถูกต้องชนิดกลุ่มนี้ของเชื้อรา บ้านต้นไม้ที่สร้างขึ้นโดยรวมกับ
ลำดับของยีนและα ef-1 rpb2
แสดงว่าคอลเลกชันเดิมถือว่าเป็น ditissima
.( nectria galligena ) และ N . confusa ไม่สมบูรณ์
เหมือนกันในลำดับดีเอ็นเอ แม้ว่าพวกเขาได้ค่อนข้างน้อย หรือความแตกต่างทางสัณฐานวิทยา
กระจอก
ชนิดระดับ ลำดับการวิเคราะห์และอินเตอร์ - ภายใน -
เฉพาะรูปแบบแสดงโดยคอลเลกชันเหล่านี้นำไปสู่การค้นพบสปีชีส์ที่
2 N . ditissimopsis และ N .
microconidia ( ตัวเลข 1 - 5 )อดีตเคย
ผสานกับเอ็น ditissima [ 30 ] และต่อมาก็ถือว่าเป็นการเฉพาะ ตัวแปรภายใน
. confusa ตามลักษณะทางสัณฐานวิทยาและลักษณะวัฒนธรรม
[ 32 ] . การวิเคราะห์ลำดับของเรา
ยังเปิดเผยว่า ได้ ditissimopsis เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเพื่อ ditissima
, N . สาขา และ nectria neomacrospora , กับ
มูลค่าเท่ากับ 100 % ซึ่งสอดคล้องกับ
สัณฐานคล้ายคลึงกัน neonectria microconidia คือ
เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเพื่อ ศึกษา punicea confusa , เอ็น , เอ็น , เอ็นและ
faginata ด้วยการสนับสนุนเท่ากับ 100% การเปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ N .

ระหว่าง microconidia confusa และได้กล่าวถึง
barcoding ดีเอ็นเอเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการประเมิน
ของความหลากหลายทางชีวภาพ การค้นพบชนิดที่คลุมเครือโดย
ดีเอ็นเอ barcoding ได้รายงานในผีเสื้อ [ 59 ] และยิว
[ 60 ] งานปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าการศึกษาแบบบูรณาการบน
สัณฐานวิทยาและดีเอ็นเอลำดับข้อมูลได้อนาคตสดใสในการสำรวจความหลากหลายของเชื้อรา

ใสชนิดและสถานประกอบการของแนวคิด