2.5. Cytokinesis-block micronucleus

2.5.

Cytokinesis-block

micronucleus

cytome

(CBMNcyt)

assay
CBMNcyt

assay

was

performed

on

the

basis

of

the

method

described

by

Fenech
[28].

The

0.5

ml

whole

blood

was

added

to

4.5

ml

RPMI

1640

(GIBCO)

containing
20%

fetal

calf

serum,

0.2

mg/ml

phytohaemagglutinin-M

(PHA-M,

GIBCO).

Two

inde-
pendent

cultures

for

each

sample

were

incubated

at

37
◦
C

for

72

h,

and

4.5

g/ml
cytochalasin

B

(Sigma)

was

added

to

each

culture

at

28

h

before

harvesting

cells.
The

cultures

were

harvested

at

72

h

after

the

initiation

by

centrifugation.

The

lym-
phocytes

were

subjected

to

mild

hypotonic

treatment

(0.075

M

KCl)

for

5

min,

then
fixed

in

fresh

fixative

solution

(methanol:acetic

acid

=

3:1)

for

20

min,

this

fixation
step

was

repeated

twice

after

a

20

min

storage

at

4
◦
C.

The

cell

suspension

was
dropped

on

microscope

slides

and

stained

with

10%

pH

6.8

Giemsa

solutions

for
10

min.

On

the

basis

of

scoring

criteria

described

by

Fenech

[28]

and

Thomas

et

al.
[29],

a

total

of

2000

binucleated

cells

per

sample

were

analyzed

to

determine

the

fre-
quencies

of

micronucleated

cells

(MCF),

micronuclei

(MNF),

nucleoplasmic

bridges

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 Cytokinesis บล็อก micronucleus cytome (CBMNcyt) วิเคราะห์CBMNcyt วิเคราะห์ ถูก ดำเนินการ บน ที่ ข้อมูลพื้นฐาน ของ ที่ วิธีการ อธิบาย โดย Fenech[28] ที่ 0.5 ml ทั้งหมด เลือด ถูก เพิ่ม ถึง 4.5 ml RPMI 1640 (GIBCO) ประกอบด้วย20% และทารกในครรภ์ ลูกวัว เซรั่ม 0.2 mg/ml phytohaemagglutinin M (ผา-M GIBCO) สอง inde-แขวน วัฒนธรรม สำหรับ แต่ละ ตัวอย่าง ถูก incubated ที่ 37◦C สำหรับ 72 h และ 4.5 g/mlcytochalasin B (ซิกมา) ถูก เพิ่ม ถึง แต่ละ วัฒนธรรม ที่ 28 h ก่อนที่จะ เก็บเกี่ยว เซลล์ที่ วัฒนธรรม ถูก เก็บเกี่ยวผลผลิต ที่ 72 h หลังจาก ที่ เริ่มต้น โดย centrifugation ที่ lym-phocytes ถูก ภายใต้ ถึง ไม่รุนแรง hypotonic รักษา (0.075 M KCl) สำหรับ 5 นาที แล้วfixed ใน สด fixative โซลูชั่น (เมทานอล: อะซิติก กรด = 3:1) สำหรับ 20 นาที นี้ fixationขั้นตอนที่ ถูก การทำซ้ำ สองครั้ง หลังจาก การ 20 นาที จัดเก็บข้อมูล ที่ 4◦ค ที่ เซลล์ ระบบกันสะเทือน ถูกลดลง บน กล้องจุลทรรศน์ ภาพนิ่ง และ สี ด้วย 10% pH 6.8 Giemsa โซลูชั่น สำหรับ10 นาที บน ที่ ข้อมูลพื้นฐาน ของ การให้คะแนน เกณฑ์ อธิบาย โดย Fenech [28] และ Thomas ร้อยเอ็ด อัล[29], การ ผลรวม ของ 2000 binucleated เซลล์ ต่อ ตัวอย่าง ถูก วิเคราะห์ ถึง กำหนด ที่ ฟรี-quencies ของ micronucleated เซลล์ (MCF), micronuclei (บด), nucleoplasmic สะพาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 .

ไซโตพลาสซึมบล็อก





( cytome ให้เกิด cbmncyt )

)




คือว่า cbmncyt

)





บนพื้นฐานของ









โดยวิธีบรรยาย เฟเนค



[ 28 ]






0.5 มิลลิลิตรทั้งหมด





เพิ่มเลือดได้








4.5 ml RPMI 1640






( gibco ) ที่มี 20 %

แม่

น่อง





เซรั่ม , 0.2 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร



( pha-m phytohaemagglutinin-m , gibco

)

2
-
ยังจี้




สำหรับวัฒนธรรม




แต่ละตัวอย่างถูก

)




◦ที่ 37
C

สำหรับ

72

H





 และ 4.5 กรัม / มิลลิลิตร cytochalasin

B

( Sigma )





ถูกเพิ่มให้

วัฒนธรรมแต่ละคน





ที่ 28

H





ก่อนเก็บเกี่ยวเซลล์






มีวัฒนธรรมที่เกี่ยว







หลังจาก 72 ชั่วโมง







โดยการปั่น



ลิม -
phocytes

)






รับการรักษาไฮโปโทนิกอ่อน





( 0.075

m

. )




5 สำหรับ



มิน แล้วจึงสดใน xed









จึง xative โซลูชั่น ( เมทานอลกรดอะซิติกกรด :



=

3 : 1 )





สำหรับ 20 นาที




ขั้นตอนนี้จึง xation




ซ้ำ คือ
2

หลังจาก



20

มิน

กระเป๋า

ที่

4
◦
C







เป็นเซลล์แขวนลอยลดลงบน








แบบสไลด์และย้อมสีด้วย






10 %
M

7





จิมซาโซลูชั่นสำหรับ 10 นาที








บนพื้นฐานของ







คะแนนเกณฑ์บรรยายโดย เฟเนค





[ 28 ]





และโทมัสอัล et

.
[ 29 ] ,







รวมของ binucleated 2000







ตัวอย่างเซลล์ต่อ

)





วิเคราะห์




หา FRE quencies -






เซลล์ของ micronucleated

( MCF )

ไมโครนิวคลีไอ

( เอม )



nucleoplasmic สะพาน