Materials and MethodsChemicals and

Materials and Methods
Chemicals and Antibodies

Trypsin EDTA, trypan blue, thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), thymoquinone and N-acetylcysteine were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), while doxorubicin was purchased from Euroasian Chemical Private Ltd. (Mumbai, India). SB203580 was purchased from Promega (WI, USA). RPMI1640 and fetal bovine serum were purchased from Hyclone (Loughborough, UK). Antibiotic-antimycotic mixture was purchased from Gemini Bio-products (West Sacramento, CA, USA). Dimethyl sulfoxide was purchased from MP Biomedicals (Solon, OH, USA). BD matrigel was purchased from BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Antibodies to Bcl-2, Bcl-xL, Ki67, XIAP, JNK, p-JNK, ERK, p-ERK and PARP were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), while survivin, p38, p-p38 and β-actin were purchased from Cell Signaling (Beverly, MA, USA). Chicken anti-rabbit IgG HRP-conjugated, chicken anti-mouse IgG HRP-conjugated, chicken anti-rabbit IgG TR-conjugated antibodies, p38 siRNA and control siRNA-A were purchased from Santa Cruz Biotechnology.

Cell lines

MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines were purchased from ATCC (Manassas, VA, USA). These cell lines were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic-antimycotic. All cell culture were maintained at 37 °C and 5% CO2 in a humidified atmosphere.

3: (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay

The anti-proliferative effect of TQ was assessed by MTT assay. TQ was dissolved in PBS containing 0.5% DMSO for all in vitro studies. Briefly, breast cancer cells were seeded (104 cells/well) in a 96-well microtiter plate followed by overnight incubation. After appropriate treatment, 10 µl MTT solution (5 mg/ml) was added to each well for 4 h. The mixture was removed carefully via pipette, and the remaining formazan crystals formed were dissolved by 100 µl DMSO. After 30 mins, the absorbance of each well was read at 570 nm with an absorbance reader (Tecan Infinite M200, Mannedorf, Switzerland).

Annexin V-propidium iodide analysis

The level of apoptosis of cancer cells was assessed with Annexin V-propidium iodide kit from Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Briefly, breast cancer cells were seeded (2.6 X 105 cells/well) in a 6-well microtiter plate followed by overnight incubation. After appropriate treatment, the cells were trypsinized, washed, and incubated with Annexin V-FITC solution for 15 mins under dark condition. After washing, the cells were analyzed with flow cytometry (CyAnTM ADP from Beckman Coulter, Brea, CA, USA) immediately after propidium iodide solution was added.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสารเคมีและแอนตี้ทริปซิน EDTA สีฟ้า trypan thiazolyl บลู tetrazolium โบรไมด์ (MTT), thymoquinone และ N acetylcysteine ซื้อจากซิก-Aldrich (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา), ขณะ doxorubicin ที่ซื้อจาก Euroasian เคมีส่วนตัว จำกัด (มุมไบ อินเดีย) SB203580 ที่ซื้อจาก Promega (WI สหรัฐอเมริกา) RPMI1640 และซีรั่มวัวครรภ์ถูกซื้อจาก Hyclone (Loughborough, UK) ส่วนผสมของยาปฏิชีวนะ antimycotic ถูกซื้อจากเจมินิไบโอผลิตภัณฑ์ (เวสต์แซคราเมนโต CA, USA) Dimethyl sulfoxide ถูกซื้อจาก Biomedicals MP (Solon, OH สหรัฐอเมริกา) BD matrigel ถูกซื้อจากเวลาออก BD (แฟรงคลินทะเลสาบ NJ สหรัฐอเมริกา) แอนตี้ Bcl 2, Bcl xL, Ki67, XIAP, JNK, p-JNK, ERK, p-ERK และ PARP ซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ซานตาครูซ CA, USA), ในขณะที่ survivin, p38, p p38 และβ-แอกตินซื้อจากเซลล์ตามปกติ (เบเวอร์ลี่ MA สหรัฐอเมริกา) ซื้อไก่กระต่ายป้องกัน IgG HRP กลวง ไก่ป้องกันเมาส์ IgG HRP กลวง ไก่กระต่ายป้องกัน IgG TR กลวงแอนตี้ p38 siRNA และควบคุม siRNA A จากซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพเซลล์รายการMCF-7 และบรรทัดที่เซลล์มะเร็งเต้านม MDA-MB-231 ถูกซื้อจาก ATCC (มานาสซาส VA สหรัฐอเมริกา) บรรทัดเหล่านี้เซลล์มีอ่างใน RPMI1640 เสริม ด้วยยาปฏิชีวนะ antimycotic 1% และ 10% ซีรั่มวัวและทารกในครรภ์ มีรักษาวัฒนธรรมเซลล์ทั้งหมดที่ 37 ° C และ 5% CO2 ในบรรยากาศ humidified3: (ทดสอบ 4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium โบรไมด์ (MTT)ผลต่อต้าน proliferative ต้นของ TQ ถูกประเมิน โดย MTT assay TQ ถูกละลายใน PBS ที่ประกอบด้วย 0.5% DMSO ศึกษาการเพาะเลี้ยงทั้งหมด สั้น ๆ เซลล์มะเร็งเต้านมได้ seeded (104 เซลล์/ดี) ใน microtiter 96 ดีใส่จานตาม ด้วยฟักตัวค้างคืน หลังการรักษาที่เหมาะสม 10 µl MTT โซลูชัน (5 mg/ml) ถูกเพิ่มไปยังแต่ละดีสำหรับ 4 h ส่วนผสมถูกเอาออกอย่างระมัดระวังผ่านเปตต์ และเหลือ formazan ผลึกเกิดขึ้นได้ส่วนยุบ โดย 100 µl DMSO หลังจาก 30 นาที absorbance ของแต่ละดีได้อ่านที่ 570 nm ด้วยเครื่องอ่าน absorbance (Tecan อนันต์ M200, Mannedorf สวิตเซอร์แลนด์)การวิเคราะห์ annexin V propidium ไอโอไดด์มีประเมินระดับการ apoptosis ของเซลล์มะเร็ง ด้วย Annexin V propidium ชุดไอโอไดด์จาก Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach เยอรมนี) สั้น ๆ เซลล์มะเร็งเต้านมได้ seeded (2.6 X 105 เซลล์/ดี) ใน microtiter ดี 6 แผ่นตาม ด้วยฟักตัวค้างคืน หลังการรักษาที่เหมาะสม เซลล์ trypsinized ล้าง และ incubated ด้วย Annexin V-FITC โซลูชันสำหรับ 15 นาทีภายใต้สภาพที่มืด หลังจากซักผ้า เซลล์ถูกวิเคราะห์ ด้วยกระแสเซลล์ (CyAnTM ADP จาก Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ทันทีหลังจากไอโอไดด์ propidium โซลูชันเพิ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เคมีและแอนติบอดีTrypsin EDTA, สีฟ้าทริแพน, thiazolyl โบรไมด์ tetrazolium สีฟ้า (MTT) thymoquinone และ N-acetylcysteine ​​ที่ซื้อมาจาก บริษัท Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, สหรัฐอเมริกา) ในขณะที่ doxorubicin ซื้อมาจาก Euroasian เคมี จำกัด ส่วนตัว . (มุมไบ, อินเดีย) SB203580 ซื้อมาจาก Promega (WI, USA) RPMI1640 และซีรั่มของทารกในครรภ์วัวที่ซื้อมาจาก Hyclone (Loughborough สหราชอาณาจักร) ผสมยาปฏิชีวนะฆ่าเชื้อราซื้อมาจากราศีเมถุนชีวภาพผลิตภัณฑ์ (เวสต์แซคราเมนโต, CA, USA) dimethyl sulfoxide ซื้อมาจาก MP Biomedicals (โซล, OH, USA) BD Matrigel ซื้อมาจาก BD ชีววิทยาศาสตร์ (แฟรงคลินเลค, นิวเจอร์ซีย์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีเพื่อ Bcl-2, Bcl-XL, Ki67, XIAP, JNK, P-JNK, ERK, P-ERK และ PARP ที่ซื้อมาจากซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ (Santa Cruz, CA, USA) ในขณะที่ survivin, p38, P-P38 และβ-โปรตีนที่ซื้อมาจากสัญญาณมือถือ (Beverly, MA, USA) ไก่ต่อต้านกระต่าย IgG HRP-ผันไก่ต่อต้านเมาส์ IgG HRP-ผันไก่ต่อต้านกระต่าย IgG แอนติบอดี TR-ผัน siRNA p38 และควบคุม siRNA-ที่ซื้อมาจากซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ. เซลล์MCF-7 และ MDA- MB-231 เซลล์มะเร็งเต้านมที่ซื้อมาจาก ATCC (ซา, VA, USA) เซลล์เหล่านี้ถูกเลี้ยงในสื่อ RPMI1640 เสริมด้วย 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์และ 1% ยาปฏิชีวนะฆ่าเชื้อรา การเพาะเลี้ยงเซลล์ทั้งหมดถูกเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและ CO2 5% ในบรรยากาศความชื้น. 3 (4,5-Dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium โบรไมด์ (MTT) ในการตรวจป้องกันการเจริญ ผลกระทบของการ TQ ได้รับการประเมินด้วยวิธี MTT TQ ถูกกลืนหายไปในพีบีเอสที่มี 0.5% DMSO สำหรับทุกการศึกษาในหลอดทดลอง สั้น ๆ เซลล์มะเร็งเต้านมเป็นเมล็ด (104 เซลล์ / ดี) ในจาน microtiter 96 หลุมตามด้วยการบ่มเพาะในชั่วข้ามคืน หลังจากการรักษาที่เหมาะสม, 10 ไมโครลิตรแก้ปัญหา MTT (5 mg / ml) ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดีสำหรับ 4 ชั่วโมง ส่วนผสมที่ถูกลบออกอย่างระมัดระวังผ่านปิเปตและผลึก formazan ที่เหลือที่เกิดขึ้นถูกเลือนหายไปจาก 100 ไมโครลิตร DMSO หลังจาก 30 นาทีการดูดกลืนแสงของดีแต่ละคนถูกอ่านได้ที่ 570 นาโนเมตรที่มีผู้อ่านดูดกลืนแสง (Tecan Infinite M200, Mannedorf, วิตเซอร์แลนด์). Annexin V-propidium วิเคราะห์ไอโอไดด์ระดับของการตายของเซลล์มะเร็งได้รับการประเมินด้วย Annexin V-propidium ชุดไอโอไดด์ จาก Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, เยอรมนี) สั้น ๆ เซลล์มะเร็งเต้านมเป็นเมล็ด (2.6 x 105 เซลล์ / ดี) ใน 6 แผ่นไมโครดีตามมาด้วยการบ่มในชั่วข้ามคืน หลังจากการรักษาที่เหมาะสมเซลล์ถูก trypsinized ล้างและบ่มกับการแก้ปัญหา Annexin V-FITC เวลา 15 นาทีภายใต้เงื่อนไขที่มืด หลังจากล้างเซลล์ที่ได้มาวิเคราะห์ด้วยโฟ (CyAnTM ADP จาก Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ทันทีหลังจากที่การแก้ปัญหาไอโอไดด์ propidium ถูกเพิ่มเข้ามา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
เคมีและแอนติบอดี

ทริป EDTA , ไตรแพนสีฟ้า , โบรไมด์ tetrazolium thiazolyl สีฟ้า ( MTT ) thymoquinone อันตรายและซื้อจากซิกม่า Aldrich ( St . Louis , MO , USA ) , ในขณะที่ดอกโซรูบิซินซื้อมาจาก euroasian เคมีเอกชนจำกัด ( มุมไบอินเดีย ) sb203580 ซื้อมาจาก promega ( WI , USA )และ rpmi1640 ครรภ์วัว เซรั่ม ซื้อมาจาก hyclone ( Loughborough , UK ) antimycotic ผสมยาปฏิชีวนะซื้อจากราศีเมถุนผลิตภัณฑ์ชีวภาพ ( West Sacramento , CA , USA ) ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ถูกซื้อจาก ส.ส. biomedicals ( โซลอน โอ สหรัฐอเมริกา ) BD matrigel ซื้อมาจาก BD BIOSCIENCES ( Franklin Lakes , NJ , USA ) แอนติบอดีที่ bcl-2 Bcl XL ki67 xiap , jnk p-jnk กา ��� , , , ,และ p-erk parp ซื้อมาจาก ซานตา ครูซ ( Santa Cruz ) , CA , USA ) , ในขณะที่ดิก P38 , , และ p-p38 บีตา - actin ซื้อจากสัญญาณมือถือ ( Beverly , MA , USA ) ไก่กระต่าย IgG anti HRP conjugated , ไก่ป้องกันเมาส์ IgG conjugated ช ไก่ป้องกันกระต่าย IgG conjugated TR แอนติบอดี และควบคุมบริษัท P38 SiRNA - เป็น ซื้อ จาก ซานตา ครูซ เทคโนโลยีชีวภาพ


เซลล์mcf-7 mda-mb-231 มะเร็งเต้านมและเซลล์มะเร็ง ซื้อมาจาก ATCC ( Manassas , VA , USA ) เซลล์เหล่านี้เพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย rpmi1640 10% fetal bovine serum และ 1% ยาปฏิชีวนะ antimycotic . ทุกเซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 37 องศา C และคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ใน humidified บรรยากาศ

3 : ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl ) - 2,5-diphenyl-2h-tetrazolium โบรไมด์ ( MTT ) )

ต่อต้านอิทธิพลของ TQ proliferative ประเมินโดย MTT assay พบ พิมพ์ดีดได้ละลาย PBS ที่มี 0.5% DMSO ทั้งหมดในหลอดทดลอง . สั้น ๆ , เซลล์มะเร็งเต้านมเป็นเมล็ด ( 104 เซลล์ / ดี ) ในแผ่นไมโคร 96 ดีตามด้วยค้างคืนการบ่ม หลังจากการรักษาที่เหมาะสม , 10 µ L MTT โซลูชั่น ( 5 mg / ml ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละหลุม 4 ชั่วโมง ส่วนผสมจะถูกลบออกผ่านทางเปตอย่างระมัดระวัง ,และที่เหลือเหลือเชื่อที่เกิดขึ้นถูกละลายด้วยµ DMSO 100 ลิตร . หลังจาก 30 นาที , การดูดกลืนแสงของแต่ละดีอ่าน 570 nm ด้วยค่า ( อ่าน m200 mannedorf TECAN อนันต์ , สวิตเซอร์แลนด์ )

v-propidium ของเซลล์การวิเคราะห์ไอโอไดด์

ระดับการตายของเซลล์มะเร็ง และเสริมด้วยชุดจาก miltenyi v-propidium ของเซลล์ชีวภาพ ( โรงเรียนดาราวิทยาลัย , เยอรมัน ) สั้น ๆเซลล์มะเร็งเต้านมเป็นเมล็ด ( 2.6 x 105 เซลล์ / ดี ) ใน 6-well ไมโครเพลทตามค้างคืนการบ่ม หลังการรักษาที่เหมาะสม เซลล์ก็ trypsinized , ล้างและแยกของเซลล์ v-fitc โซลูชั่นสำหรับ 15 นาที ในสภาพมืด หลังจากการล้างเซลล์มาวิเคราะห์ด้วยเครื่องนับเซลล์ ( cyantm ADP จากเบคแมน คูลเตอร์เบรีย , แคลิฟอร์เนีย , ,สหรัฐอเมริกา ) ทันทีหลังจากโซลูชั่นไอโอไดด์ propidium ถูกเพิ่มเข้ามา