[0019] Figure 9: shows the expressi

[0019] Figure 9: shows the expression เวกเตอร์ pTLPC26 (also called pTlc26) which encodes a fusion protein ซึ่งประกอบรวมด้วย the OmpA signal sequence (OmpA) and a human tear ไลโปคาลิน มิวทีน followed by the Strep-tag II. Both the BstXI-restriction ตำแหน่ง used for the cloning of the mutated gene cassette and the restriction ตำแหน่ง flanking the structural gene are labeled. Gene expression is under the control of the tetracycline promoter/operator (tetP10). Transcription is terminated at the lipoprotein transcription terminator (t1pp). The เวกเตอร์ further ประกอบรวมด้วย an origin of replication (ori), the intergenic บริเวณ of the filamentous phage fl (fl• IG), the ampicillin resistance gene (amp) and the tetracycline repressor gene (tetR). A relevant segment of the nucleic acid sequence of pTLPC26 is given in the sequence listing as SEQ ID NO: 35. The segment begins with the XbaI restriction ตำแหน่ง and ends with the HindIII restriction ตำแหน่ง. The เวกเตอร์ elements outside this บริเวณ are identical with the เวกเตอร์ pASK75, the. complete nucleotide sequence of which is given in the German patent publication DE 44
17 598 Al.

[0020] Figure 10: depicts an alignment of amino acid sequences of certain hum.antear ไลโปคาลิน based มิวทีน (listed as SEQ ID NOs: 2-28) in comparison with the polypeptide sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (SEQ ID NO: 1).

[0021] Figure 11: รูป 11 A provides the expected distribution of amino acids encoded for Example 3. Note that for clarity, all amino acids having a frequency of less than
1 % are omitted; the amber stop codon (TAG) is taken as encoding glutamine because a codon suppresor bacterial strain, TGl F, is used in the phage display process. In addition, experimental data obtained from the sequencing of maturation libraries (รูป 11 B and รูป 11
C) shows that there is a good match between the expected and the experimental distribution, albeit with the frequency of serine being higher than desired, reflecting either biases in oligo synthesis or oligo assembly by PCR. In line with this finding, the experimentally obtained frequency of mutation distributions for two libraries (รูป 11 E andรูป 11 F) are close to the theoretically expected distribution (รูป 11 D), but shifted to a lower frequency.

[0022] Figure 12: depicts a thermogram, obtained from a nano Differential Scanning Calorimeter ("nanoDSC") measurement using a capillary nanoDSC instrument (Q2000, TA Instruments), representing overlays of melting curves of ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NOs: 63-65). Melting curves of thermo-stabilized derivatives (SEQ ID NOs: 63-
65) are significantly shifted compared to SEQ ID NO: 13.


[0023] Figure 13: provides typical measurements of on-rate and off-rate by Surface Plasmon Resonance for the ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NOs: 62-71). รูป13A-รูป13J corresponds to SEQ ID NOs: 62-71 respectively. The resulting dissociation constants (KD), the association rates (kon) and the dissociation rates (koff) to ฮิวเมน PCSK9 ("hPCSK9") (SEQ ID NO: 34) are summarized in Table 10 of Example 17.

[0024] Figure 14: depicts an alignment of amino acid sequences of certain human tear ไลโปคาลิน based มิวทีน (listed as SEQ ID NOs: 13, 22, 62-71) in comparison with the polypeptide sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (SEQ ID NO: 1).

IV. DETAILED DESCRIPTION OF THE การเปิดเผย


[0025] In one aspect, the present การเปิดเผย provides มิวทีน of human tear ไลโปคาลิน that bind to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 or PCSK9. ในบางรุรุ, the ไลโปคาลิน มิวทีน have a high แอฟฟินิตี้ for PCSK9. PCSK9 as a target of a มิวทีน of the การเปิดเผยนี้ is typically a mammalian protein, for example, a non-human primate
protein or a human protein. Full-length human PCSK.9 has the amino acid sequence shown in

SEQ ID NO: 34.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[0019] รูปที่ 9: แสดงให้เห็นถึงการแสดงออกเวกเตอร์ pTLPC26 (เรียกว่ายัง pTlc26) ซึ่งเข้ารหัสโปรตีนฟิวชั่นซึ่งประกอบรวมด้วยลำดับสัญญาณ OMPA (OMPA) และการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลินมิวทีนตามด้วย Strep -tag ครั้งที่สอง ทั้ง BstXI-ข้อ จำกัด ตำแหน่งที่ใช้สำหรับการโคลนเทปยีนกลายพันธุ์และข้อ จำกัด ตำแหน่งขนาบยีนโครงสร้างมีความโดดเด่น การแสดงออกของยีนที่อยู่ภายใต้การควบคุมของผู้ก่อการ tetracycline / ผู้ประกอบการ (tetP10) ถอดความถูกยกเลิกที่เทอร์มิไลโปโปรตีนถอดความ (t1pp) เวกเตอร์ต่อไปประกอบรวมด้วยต้นกำเนิดของการจำลองแบบ (Ori) ที่ intergenic บริเวณชั้นของใยฟาจ (ชั้น• IG) ยีนต้านทาน ampicillin นี้ (แอมป์) และ tetracycline อดกลั้นยีน (tetr) ส่วนที่เกี่ยวข้องของลำดับนิวคลีอิกของกรด pTLPC26 จะได้รับในลำดับรายการเป็น SEQ ID NO: 35 ส่วนที่เริ่มต้นด้วยข้อ จำกัด XbaI ตำแหน่งและจบลงด้วยข้อ จำกัด HindIII ตำแหน่ง องค์ประกอบเวกเตอร์นอกบริเวณนี้เหมือนกันกับเวกเตอร์ pASK75 ที่ ลำดับเบสที่สมบูรณ์ของการที่จะได้รับการตีพิมพ์ในสิทธิบัตรเยอรมัน DE 44
17 598 อัล. [0020] รูปที่ 10: แสดงให้เห็นถึงการจัดเรียงลำดับของกรดอะมิโนบาง hum.antear ไลโปคาลินตามมิวทีน (การระบุว่าเป็น SEQ ID NOS: 2-28) ในการเปรียบเทียบกับลำดับ polypeptide ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (SEQ ID NO:. 1) [0021] รูปที่ 11: รูป 11 มีการกระจายที่คาดหวังของกรดอะมิโนที่เข้ารหัสสำหรับตัวอย่าง 3. โปรดทราบว่าเพื่อความชัดเจนกรดอะมิโนทั้งหมดที่มีความถี่น้อยกว่า1% จะถูกตัดออก; สีเหลืองอำพันหยุด codon นี้ (TAG) จะมาเป็นเข้ารหัส glutamine เพราะ codon suppresor สายพันธุ์แบคทีเรีย TGL F ถูกนำมาใช้ในกระบวนการการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์ นอกจากนี้ข้อมูลการทดลองที่ได้รับจากการจัดลำดับของห้องสมุดการเจริญเติบโต (รูปที่ 11 บีและรูป 11 C) แสดงให้เห็นว่ามีการแข่งขันที่ดีระหว่างคาดและการกระจายการทดลองแม้จะมีความถี่ของซีรีนเป็นที่สูงกว่าที่ต้องการสะท้อนให้เห็นถึงทั้งอคติ ในการสังเคราะห์ Oligo หรือประกอบ Oligo โดยวิธี PCR ในบรรทัดที่มีการค้นพบนี้ความถี่ที่ได้รับการทดลองของการกระจายการกลายพันธุ์สองห้องสมุด (รูปที่ 11 อีและรูป 11 F) ใกล้เคียงกับการจัดจำหน่ายคาดว่าในทางทฤษฎี (รูป 11 D) แต่ย้ายไปความถี่ต่ำ. [0022] รูปที่ 12 : แสดงให้เห็น thermogram ที่ได้รับจากนาโน Differential Scanning Calorimeter ("nanoDSC") การวัดโดยใช้ฝอยเครื่องมือ nanoDSC (โมเด็ม Q2000, เครื่องมือ TA) คิดเป็นภาพซ้อนทับของเส้นโค้งการละลายของไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 13 และ SEQ ID NOS: 63-65) ละลายเส้นโค้งของอนุพันธ์เทอร์โมมีความเสถียร (SEQ ID NOS: 63 65) ขยับอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ SEQ ID NO: 13 [0023] รูปที่ 13: ให้วัดในแบบฉบับของอัตราและอัตราการออกจากพื้นผิว Plasmon Resonance สำหรับ ไลโปคาลินมิวทีน (NOS SEQ ID: 62-71) รูป 13A- รูป 13J สอดคล้องกับ NOS SEQ ID: 62-71 ตามลำดับ ค่าคงที่แยกตัวออกผล (KD) อัตราสมาคม (กรณ์) และอัตราการแยกตัวออก (Koff) เพื่อฮิวเมน PCSK9 ("hPCSK9") (SEQ ID NO: 34) ได้สรุปไว้ในตารางที่ 10 ของตัวอย่าง 17 [0024] รูปที่ 14: แสดงให้เห็นถึงการจัดตำแหน่งของลำดับกรดอะมิโนของการฉีกขาดของมนุษย์บางไลโปคาลินตามมิวทีน (การระบุว่าเป็น SEQ ID NOS: 13, 22, 62-71) ในการเปรียบเทียบกับลำดับ polypeptide ของไลโปคาลิ นน้ำตามนุษย์เต็มวัย (SEQ ID NO: 1). IV อธิบายรายละเอียดของการเปิดเผย[0025] ในแง่มุมหนึ่งที่ปัจจุบันการเปิดเผยให้มิวทีนของการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลินที่ผูกไว้กับ proprotein convertase subtilisin / Kexin ประเภท 9 หรือ PCSK9 ในบางรุรุที่ไลโปคาลินมิวทีนมีสูงแอฟฟินิตี้สำหรับ PCSK9 PCSK9 เป็นเป้าหมายหนึ่งของมิวทีนของการเปิดเผยนี้โดยปกติจะเป็นโปรตีนที่เลี้ยงลูกด้วยนมเช่นเจ้าคณะไม่ใช่มนุษย์โปรตีนหรือโปรตีนของมนุษย์ ยาวเต็มรูปแบบของมนุษย์ PCSK.9 มีลำดับกรดอะมิโนที่แสดงในSEQ ID NO: 34

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ 0019 ] รูปที่ 9 : แสดงสีหน้าเวกเตอร์ ptlpc26 ( เรียกว่า ptlc26 ) ซึ่งเป็นโปรตีนที่ Intel ซึ่งประกอบรวมด้วยสูงสุดสัญญาณลำดับ ( สูงสุด ) และเป็นคนฉีกไลโปคาลินมิวทีนตามด้วย Strep แท็ก 2ทั้ง bstxi จำกัดตำแหน่งใช้สำหรับการโคลนยีนกลายพันธุ์เทปและข้อ จำกัด ตำแหน่ง flanking ยีนโครงสร้างป้าย การแสดงออกของยีนอยู่ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ / tetracycline ผู้ประกอบการ ( tetp10 ) ถอดความสิ้นสุดลงในไลโปโปรตีน ( t1pp transcription terminator )การเวกเตอร์เพิ่มเติมประกอบรวมด้วยกำเนิดซ้ำ ( ori ) , บริเวณส่าของ FL เฟจเส้นใย ( FL - IG ) , แอมพิต้านทานยีน ( แอมป์ ) และ tetracycline ผู้ควบคุมยีน ( สี่ ) ส่วนที่เกี่ยวข้องของลำดับดีเอ็นเอของ ptlpc26 ให้ในลำดับรายการที่ seq ไม่มี ID : 35ส่วนเริ่มต้นด้วย xbai จำกัดตำแหน่ง และจบด้วย - ข้อ จำกัด ตำแหน่ง . การเวกเตอร์องค์ประกอบภายนอกนี้บริเวณเหมือนกันกับเวกเตอร์ pask75 , . ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สมบูรณ์ของที่ได้รับในสิ่งพิมพ์สิทธิบัตรเยอรมันเดอ 44
17 71 อัล . .

[ 0020 ] รูปที่ 10 :อธิบายการเรียงตัวของกรดอะมิโนบาง hum.antear ไลโปคาลินมิวทีนตาม ( แสดงเป็นหมายเลข seq id : 2-28 ) ในการเปรียบเทียบกับพอลิเพปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ( seq id : 1 )

[ ] รูป รูปภาพ รูปที่ 11 : 11 แสดงคาดว่าการกระจายของกรดอะมิโนที่สำคัญตัวอย่าง 3 ทราบว่าเพื่อความชัดเจนทั้งหมดกรดอะมิโนที่มีความถี่น้อยกว่า
1 % จะถูกตัดออก ; สีเหลืองอำพันรหัสหยุด ( แท็ก ) จะถ่ายเป็นเพราะการเข้ารหัสและรหัส suppresor แบคทีเรียสายพันธุ์ tgl F , ใช้ในเฟจแสดงกระบวนการ นอกจากนี้ ข้อมูลที่ได้จากการจัดลำดับของห้องสมุดวุฒิภาวะ ( รูป 11 B และรูป 11
c ) แสดงให้เห็นว่ามีการแข่งขันที่ดีระหว่างความคาดหวังและการทดลอง แม้จะมีความถี่ของเซรีนถูกสูงกว่าที่ต้องการสะท้อนให้อคติในการสังเคราะห์โอลิโกโอลิโกหรือประกอบโดย PCR สอดคล้องกับการค้นหานี้ผลที่ได้ ความถี่ของการเปลี่ยนแปลงสองห้องสมุด ( รูป E และ F รูป 11 11 ) ใกล้เคียงกับที่คาดไว้ตามทฤษฎีการกระจาย ( รูป 11 D ) แต่เปลี่ยนความถี่ต่ำ

[ 0022 ] รูปที่ 12 : ภาพเทอร์โมแกรมที่ได้รับจากนาโน differential Scanning Calorimeter ( " nanodsc " ) วัด ใช้ปลายนิ้ว nanodsc เครื่องดนตรี ( q2000 TA เครื่องมือ )แสดงภาพซ้อนทับของเส้นโค้งของไลโปคาลินละลายมิวทีน ( seq id : 13 หมายเลข seq id : 63-65 ) ละลายเส้นโค้งของเทอร์โมมีอนุพันธ์ ( seq id หมายเลข : 63 -
65 ) เราจะเปลี่ยนเทียบกับ seq id : 13


[ 0023 ] รูปที่ 13 : แสดงโดยทั่วไปการวัดอัตรา และปิดเท่ากันโดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิวสำหรับไลโปคาลินมิวทีน ( seq id 1 .