General Procedure Purify template p

General Procedure

Purify template plasmid DNA from a dam+ Escherichia coli strain (to ensure that all GATC sites are methylated for later digestion with DpnI).
Design forward and reverse primers that will bind to the region of DNA you want to mutate but that contain the modifications you wish to make. See the CAD tool PrimerX.
Run a primer-extension reaction with a proof-reading, non-displacing polymerase such as Pfu DNA polymerase. This results in nicked circular strands of the plasmid.
Cut up the template DNA with DpnI.
Transform the circular nicked DNA into a highly competent strain such as XL1-Blue. These cells will repair the nicks and not restrict the unmodified product DNA.
Select colonies with the correct DNA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขั้นตอนทั่วไป บริสุทธิ์แม่ plasmid DNA จากเขื่อน + ต้องใช้ Escherichia coli (เพื่อให้แน่ใจว่า เว็บไซต์ GATC ทั้งหมดเป็น methylated สำหรับย่อยอาหารต่อด้วย DpnI) ต้องออกไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ที่จะผูกกับภูมิภาคของดีเอ็นเอคุณกลายพันธุ์ แต่ที่ประกอบด้วยการปรับเปลี่ยนที่คุณต้องการให้ ดูเครื่องมือ CAD PrimerX ทำปฏิกิริยาต่อรองพื้น ด้วยเป็นหลักฐานอ่าน ฎพยัคฆ์ไม่พอลิเมอเรสเช่น Pfu ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ซึ่งผล strands nicked กลมของ plasmid ตัดค่าแบบดีเอ็นเอกับ DpnI แปลง DNA nicked กลมเป็นต้องใช้ความสามารถสูงเช่นบลู XL1 เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซม nicks และไม่จำกัด DNA unmodified ผลิตภัณฑ์ เลือกอาณานิคมกับดีเอ็นเอถูกต้อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ทั่วไปขั้นตอนเพียวริฟายดีเอ็นเอแม่แบบพลาสมิดจากเขื่อน + สายพันธุ์ Escherichia coli (เพื่อให้แน่ใจว่าทุกเว็บไซต์ GATC ถูก methylated สำหรับการย่อยอาหารต่อมากับ DpnI) การออกแบบไปข้างหน้าและไพรเมอร์ที่จะผูกกับภูมิภาคของดีเอ็นเอของคุณต้องการที่จะกลายพันธุ์ย้อนกลับ แต่ที่มีการปรับเปลี่ยน คุณต้องการให้ ดูเครื่องมือ CAD PrimerX เรียกปฏิกิริยาประถมศึกษาขยายที่มีหลักฐานการอ่านโพลิเมอร์ไม่แทนที่เช่น Pfu ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ ซึ่งส่งผลให้เส้นวงกลมจับของพลาสมิดตัดขึ้นดีเอ็นเอแม่แบบที่มี DpnI แปลงดีเอ็นเอแหว่งวงกลมเป็นสายพันธุ์ที่มีความสามารถสูงเช่น XL1 สีฟ้า เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซมชื่อเล่นและไม่ จำกัด สินค้าที่ยังไม่แปรดีเอ็นเอเลือกโคโลนีที่มีดีเอ็นเอที่ถูกต้อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทั่วไปแม่แบบพลาสมิดดีเอ็นเอบริสุทธิ์ขั้นตอนจากเขื่อน Escherichia coli สายพันธุ์ ( เพื่อให้แน่ใจว่าเว็บไซต์ gatc ทั้งหมด methylated ภายหลังการย่อยอาหารด้วย dpni ) .
ออกแบบไปข้างหน้าและย้อนกลับวิธีที่จะผูกกับภูมิภาคของ DNA ที่คุณต้องการเปลี่ยนแปลง แต่ที่มีการปรับเปลี่ยนที่คุณต้องการเพื่อให้ เห็นเครื่องมือ CAD primerx .
เรียกปฏิกิริยาการรองพื้นด้วยหลักฐานการอ่านไม่แทนที่การเช่นดีเอ็นเอพอลิเมอเรสพีเอฟยู . ผลนี้ในการถักวงกลมแหว่งของพลาสมิด
ตัดแม่แบบดีเอ็นเอกับ dpni .
เปลี่ยนวงกลมแหว่งดีเอ็นเอเป็นสายพันธุ์ที่มีความสามารถสูง เช่น xl1 สีฟ้า เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซมบาดแผล และไม่จํากัดดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์แปร .
เลือกอาณานิคมกับดีเอ็นเอที่ถูกต้อง