Sample preparation for LC-MS/MSIn s

Sample preparation for LC-MS/MS
In solution trypsin digestion. SGEs were reduced, alkylated and digested with trypsin for
LC-MS/MS analysis. Briefly, 50 μg of SGE was denatured using 4M urea. After that disulphide
bonds of the proteins were reduced by incubating at 560 C for 1 hour with dithiothreitol (DTT,
10mM). After reduction, proteins were alkylated with iodoacetamide (IAA, 25mM) in dark for
30 min at 250 C. Subsequently, ammonium bicarbonate (NH4HCO3, 100mMpH 8.1) was
added to the protein solution to reduce the urea concentration to 0.5M. Finally, the protein
lysates were digested in to peptides by incubating with trypsin: substrate ratio of 1:50 at 37°C
overnight. This trypsin digest obtained was dried in a speed vac till complete dryness. Samples
were cleaned and desalted using C18 packed ziptip for further analysis by nano LC-MS/MS.
One-dimensional gel electrophoresis (1-DE). 1-DE experiments were performed for fractionation
of SGE samples of SFmosquitoes. Briefly, 27 μg of SGE sample was mixed with sample
buffer (0.625MTrisHCl, 10% SDS, glycerol, and distilled water) containing β-mercaptoethanol

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การเตรียมตัวอย่างสำหรับ LC MS/MSในการแก้ปัญหาทริปซินย่อยอาหาร SGEs ลดลง คีเลต และย่อยสลาย ด้วยทริปซินสำหรับการวิเคราะห์ LC MS/MS สั้น ๆ 50 μของเป็นโปรแกรมแบบขนานคือเอทิลแอลกอฮอล์โดยใช้ยูเรีย 4 เมตร หลังจากที่ไดซัลไฟด์พันธบัตรของโปรตีนลดลง incubating ที่ 560 C 1 ชั่วโมงกับ dithiothreitol (DTT10 มม.) . หลังจากลด โปรตีนถูกคีเลตกับ iodoacetamide (IAA, 25 มม.) ในมืดสำหรับ30 นาทีที่ 250 องศาเซลเซียส ต่อมา แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต (NH4HCO3, 100mMpH 8.1) คือเพิ่มเพื่อการแก้ไขปัญหาโปรตีนเพื่อลดความเข้มข้นของยูเรีย 0.5 เมตร ในที่สุด โปรตีนlysates ถูกย่อยในการเปปไทด์ โดย incubating กับทริปซิน: สารตั้งต้นอัตราส่วน 1:50 ที่ 37° Cพักค้างคืน นี้ทริปซินย่อยที่ได้รับถูกอบแห้งใน vac เร็วจนแห้งสมบูรณ์ ตัวอย่างได้ทำความสะอาด และใช้บรรจุ ziptip เพื่อการวิเคราะห์ โดยนาโน LC MS/MS C18 desaltedเจ one-dimensional อิ (1-DE) ดำเนินการทดลอง 1-DE สำหรับแยกตัวอย่างเป็นโปรแกรมแบบขนานของ SFmosquitoes สั้น ๆ μ 27 เป็นโปรแกรมแบบขนานอย่างถูกผสม ด้วยตัวอย่างบัฟเฟอร์ (0.625MTrisHCl, 10% SDS กลีเซอรอล และน้ำกลั่น) ที่ประกอบด้วยβ-mercaptoethanol

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเตรียมตัวสำหรับ LC-MS / MS
ในการแก้ปัญหา trypsin การย่อยอาหาร SGEs ถูกลดลง alkylated และย่อยด้วย trypsin สำหรับ
การวิเคราะห์ LC-MS / MS สั้น ๆ , 50 ไมโครกรัมของ SGE ถูกเอทิลแอลกอฮอล์ใช้ 4M ยูเรีย หลังจากนั้น disulphide
พันธบัตรของโปรตีนลดลงในระยะฟักตัว 560 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงกับ dithiothreitol (DTT,
10 mM) หลังจากที่ลดลงโปรตีนเป็น alkylated กับ iodoacetamide (IAA, 25mm) ในที่มืดสำหรับ
30 นาทีที่ 250 องศาเซลเซียสต่อจากนั้นแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต (NH4HCO3, 100mMpH 8.1) คือ
เพิ่มเพื่อแก้ปัญหาโปรตีนเพื่อลดความเข้มข้นของยูเรียเพื่อ 0.5M สุดท้ายโปรตีน
lysates ถูกย่อยในเปปไทด์จากการบ่มด้วย trypsin อัตราส่วนสารตั้งต้น 1:50 ที่ 37 ° C
ในชั่วข้ามคืน trypsin นี้แยกแยะได้ถูกทำให้แห้งใน VAC ความเร็วจนแห้งสมบูรณ์ กลุ่มตัวอย่าง
ได้รับการทำความสะอาดและใช้ desalted C18 บรรจุ Ziptip สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปโดยนาโน LC-MS / MS.
หนึ่งมิติ gel electrophoresis (1-de) 1-de ทดลองดำเนินการสำหรับการแยก
ตัวอย่าง SGE ของ SFmosquitoes สั้น ๆ , 27 ไมโครกรัมของกลุ่มตัวอย่าง SGE ผสมกับตัวอย่าง
บัฟเฟอร์ (0.625MTrisHCl 10% SDS, กลีเซอรีนและน้ำกลั่น) ที่มีβ-mercaptoethanol

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเตรียมตัวอย่างสำหรับอินซูลินรักษาโรคในสารละลายเอนไซม์ย่อยอาหาร sges ถูกลด alkylated และย่อยด้วยเอนไซม์สำหรับการวิเคราะห์อินซูลิน MS สั้น ๆ , 50 กรัม ใช้μขนานถูกใช้ 4M ยูเรีย หลังจากที่ไดซัลไฟด์หุ้นกู้ของโปรตีนลดลง โดยการแช่ที่ 560 C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงกับบัตรแข็ง ( DTT ,10mm ) หลังจากการลดโปรตีน เป็น alkylated กับ iodoacetamide ( ลิกรัม 25mm ) ในที่มืดสำหรับ30 นาทีที่ 250 องศาเซลเซียส ต่อมา แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต ( nh4hco3 100mmph 8.1 , ) คือเพิ่มโปรตีนโซลูชั่นเพื่อลดยูเรียความเข้มข้น 0.5 . ในที่สุด , โปรตีนlysates ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ เปป โดยการแช่ในอัตราส่วน 1 : 50 37 ° C ที่พื้นผิวเพียงชั่วข้ามคืน ทริปนี้ได้ถูกย่อยแห้งใน Vac แห้งเร็วจนเสร็จสมบูรณ์ ตัวอย่างสะอาด desalted ใช้ c18 บริการ ziptip สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปโดยอินซูลินคุณนาโนหนึ่งมิติ gel electrophoresis ( 1-de ) 1-de ทดลองสำหรับการตัวอย่างของขนาน sfmosquitoes . สั้น ๆ , 27 μกรัม SGE ตัวอย่างผสมกับตัวอย่างบัฟเฟอร์ ( 0.625mtrishcl 10% SDS , กลีเซอรอล และน้ำกลั่นที่มีบีตา - mercaptoethanol