ACC deaminase activity assayACC dea

ACC deaminase activity assay

ACC deaminase activity was measured according to a protocol modified from Honma and Shimoruma [11] and Ma et al. [16]. Briefly, rhizobial cells were grown in 15 ml YEM medium at 28 °C, 200 rpm for 3 d until the cells reached an early stationary phase. Cells were washed twice with minimal medium and resuspended in 15 ml of YEM-supplemented minimal medium containing 1 mM ACC followed by incubation at 28 °C, 200 rpm for 40 h to induce ACC deaminase enzyme production. Cells were collected and washed twice with 0.1 M Tris–HCl (pH 7.5), and resuspended in 1 ml of 0.1 M Tris–HCl (pH 8.5). The cells were labilized using 5% toluene (v/v) and incubated at room temperature for 5 min [16]. The cells were lysed by sonication with a pulse of 40 s at high power on ice and 1 min cooling, for 10 cycles using an ultrasonicator (Sonic Dismembrator, Model 100, Fisher Scientific), and cell debris was precipitated by centrifugation at 10,000g for 20 min. An aliquot of 200 μl of the supernatant containing crude enzyme was incubated with 50 mM ACC at 30 °C for 1 h. The reaction of the crude enzyme with ACC was stopped by addition of 1.8 ml of 0.56 M HCl, and 0.3 ml of 0.1% (w/v) 2,4-dinitrophenylhydrazine (prepared in 2 M HCl solution) to the mixture and incubated at 30 °C for 15 min. The colorimetric reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine was stopped by adding 2 ml of 2 M NaOH, and the absorbance was determined at 540 nm. One unit of the enzyme indicates the activity forming 1 μmol of α-ketobutyrate per h under these conditions [11]. A standard curve for α-ketobutyrate was prepared at five concentrations (0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 μmol), and 200 μl of solutions were used in the reaction. The supernatant containing the crude enzyme was also used to determine protein concentrations [14].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ACC deaminase กิจกรรมทดสอบACC deaminase activity was measured according to a protocol modified from Honma and Shimoruma [11] and Ma et al. [16]. Briefly, rhizobial cells were grown in 15 ml YEM medium at 28 °C, 200 rpm for 3 d until the cells reached an early stationary phase. Cells were washed twice with minimal medium and resuspended in 15 ml of YEM-supplemented minimal medium containing 1 mM ACC followed by incubation at 28 °C, 200 rpm for 40 h to induce ACC deaminase enzyme production. Cells were collected and washed twice with 0.1 M Tris–HCl (pH 7.5), and resuspended in 1 ml of 0.1 M Tris–HCl (pH 8.5). The cells were labilized using 5% toluene (v/v) and incubated at room temperature for 5 min [16]. The cells were lysed by sonication with a pulse of 40 s at high power on ice and 1 min cooling, for 10 cycles using an ultrasonicator (Sonic Dismembrator, Model 100, Fisher Scientific), and cell debris was precipitated by centrifugation at 10,000g for 20 min. An aliquot of 200 μl of the supernatant containing crude enzyme was incubated with 50 mM ACC at 30 °C for 1 h. The reaction of the crude enzyme with ACC was stopped by addition of 1.8 ml of 0.56 M HCl, and 0.3 ml of 0.1% (w/v) 2,4-dinitrophenylhydrazine (prepared in 2 M HCl solution) to the mixture and incubated at 30 °C for 15 min. The colorimetric reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine was stopped by adding 2 ml of 2 M NaOH, and the absorbance was determined at 540 nm. One unit of the enzyme indicates the activity forming 1 μmol of α-ketobutyrate per h under these conditions [11]. A standard curve for α-ketobutyrate was prepared at five concentrations (0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 μmol), and 200 μl of solutions were used in the reaction. The supernatant containing the crude enzyme was also used to determine protein concentrations [14].

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แม็กกิจกรรม deaminase ทดสอบกิจกรรมแม็ก deaminase วัดตามโปรโตคอลที่ดัดแปลงมาจาก Honma และ Shimoruma [11] และ Ma, et al [16] สั้น ๆ , เซลล์ไรโซเบียมที่ปลูกในสื่อ YEM 15 ml ที่ 28 ° C, 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 3 จนกว่าเซลล์ถึงเฟสต้น เซลล์ที่ถูกล้างครั้งที่สองที่มีขนาดกลางน้อยที่สุดและ resuspended ใน 15 มล. ของกลางน้อยที่สุด YEM-เสริมที่มี 1 มิลลิแม็กตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิ 28 ° C, 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 40 ชั่วโมงเพื่อก่อให้เกิดการผลิตแม็ก deaminase เอนไซม์ เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมและล้างครั้งที่สอง 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) และ resuspended ใน 1 มิลลิลิตร 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) เซลล์ถูก labilized ใช้โทลูอีน 5% (v / v) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที [16] เซลล์ถูก lysed โดย sonication กับชีพจรของ 40 s ที่พลังงานสูงบนน้ำแข็งและ 1 นาทีระบายความร้อนสำหรับ 10 รอบใช้ ultrasonicator (โซนิค Dismembrator รุ่น 100, Fisher Scientific) และเศษเซลล์ตกตะกอนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000g สำหรับ 20 นาที หาร 200 ไมโครลิตรของสารละลายที่มีเอนไซม์ถูกบ่มกับแม็กขนาด 50 มมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปฏิกิริยาของเอนไซม์กับแม็กก็หยุดโดยนอกเหนือจาก 1.8 มล. 0.56 M HCl และ 0.3 มิลลิลิตร 0.1% (w / v) 2,4-dinitrophenylhydrazine (จัดทำขึ้น 2 การแก้ปัญหา M HCl) เพื่อผสมและบ่มที่ อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที ปฏิกิริยากับสี 2,4-dinitrophenylhydrazine ก็หยุดโดยการเพิ่ม 2 มิลลิลิตร 2 M NaOH และการดูดกลืนแสงที่ถูกกำหนดที่ 540 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของเอนไซม์บ่งชี้ว่ากิจกรรมการขึ้นรูป 1 ไมโครโมลของα-ketobutyrate ต่อชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ [11] เส้นโค้งมาตรฐานα-ketobutyrate ถูกจัดทำขึ้นที่ห้าความเข้มข้น (0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 ไมโครโมล) และ 200 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาถูกนำมาใช้ในการทำปฏิกิริยา สารละลายที่มีเอนไซม์ยังถูกใช้ในการตรวจสอบความเข้มข้นของโปรตีน [14]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีทำแผนที่ของกิจกรรมกิจกรรมทำแผนบัญชีวัดตามโปรโตคอลที่ดัดแปลงจากฮอน และ shimoruma [ 11 ] และ ma et al . [ 16 ] แค่เพียงเซลล์เติบโตใน 15 ml แย้มขนาดกลางที่ 28 ° C , 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 3 D จนกว่าเซลล์ถึงเฟสอยู่กับที่ก่อน เซลล์มีการล้าง 2 ครั้งและใน minimal medium resuspended 15 มิลลิลิตร เติม BAP ความเข้มข้น 1 มิลลิแย้มน้อย บัญชี ตามด้วยการบ่มที่ 28 ° C , 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 40 ชั่วโมงเพื่อกระตุ้นการผลิตเอนไซม์อะมิเนสบัญชี . เซลล์ถูกเก็บและล้าง 2 ครั้ง ด้วย 0.1 M HCl ทริส– ( pH 7.5 ) , และ resuspended ใน 1 มิลลิลิตร ทั้งนี้ความเข้มข้น 0.1 M HCl และ pH 8.5 ) เซลล์ก็ labilized โทลูอีนโดยใช้ 5% ( v / v ) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที [ 16 ] เซลล์ก็ lysed โดย sonication ที่มีชีพจร 40 s ที่พลังงานสูงแข็งและ 1 นาทีเย็นสำหรับ 10 รอบ ใช้ ultrasonicator ( โซนิค dismembrator รุ่น 100 , ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ) และเศษเซลล์มาตกตะกอน โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 10000g 20 นาทีเป็นส่วนลงตัวของ 200 μ L ของน่านที่มีเอนไซม์คือ บ่มกับ 50 mm บัญชี 30 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปฏิกิริยาของเอนไซม์ดิบกับบัญชีถูกหยุดโดยเพิ่ม 1.8 มิลลิลิตร ( M HCl , 0.3 มล. และ 0.1% ( w / v ) 2,4-dinitrophenylhydrazine ( ที่เตรียมไว้ใน 2 M กรดไฮโดรคลอริก ) ส่วนผสมและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 15 นาที ปฏิกิริยากับ 2,4-dinitrophenylhydrazine 7.4 ถูกหยุดโดยการเพิ่ม 2 ml 2 M NaOH และดูดกลืนตั้งใจ 540 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ พบว่า กิจกรรมสร้าง 1 μโมลของแอลฟา ketobutyrate ต่อชั่วโมง ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ [ 11 ] เส้นโค้งมาตรฐานของแอลฟา ketobutyrate เตรียม 5 ความเข้มข้น 0 , 0.02 , 0.04 , 0.06 , 0.08 , μ 0.1 โมล ) และ 200 μผมของโซลูชั่นที่ใช้ในการเกิดปฏิกิริยา และน่าน ประกอบด้วยเอนไซม์ดิบถูกใช้เพื่อตรวจสอบโปรตีนความเข้มข้น [ 14 ]