Quantitative real-time PCR analysis

Quantitative real-time PCR analysis. RNA extraction and cDNA synthesis were
performed as the above described. The synthesized cDNAs were diluted 1 times in
RNase/DNase-free water. Quantitative real-time PCR analysis was carried out using
the CFX96TM Real-Time System (C1000TM Thermal Cycler, Bio-Rad). All reactions
were performed using the SYBRH Premix Go Taq II kit (Promega, China) in a 10 ml
total sample volume (5.0 ml 2 3 SYBR Premix Go Taq, 0.5 ml primers, 1.0 ml cDNA,
3.5 ml ddH2O). To remove the effect of genomic DNA and the template from
environment, NTC (no template control) and NRT (no reverse transcription control)
were performed. Three replications for each sample were used and standard curves
were run simultaneously. Melt curve analysis of qPCR samples revealed that there was
only one product for each gene primer reaction. The PCR products were sequenced to
confirm the specific amplification. SlCAC58 gene was used as internal standard in
tomato tissues. The primers SlFYFL(RT)-F and SlFYFL(RT)-R (Table S1) were used
to determine the expression level of SlFYFL in wild type and transgenic lines.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เชิงปริมาณวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ สกัดอาร์เอ็นเอและการสังเคราะห์ cDNAดำเนินการ ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น CDNAs สังเคราะห์ที่ผสม 1 ครั้งในน้ำ RNase/DNase-ฟรี เชิงปริมาณวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ได้รับการดำเนินการใช้CFX96TM แบบเรียลไทม์ระบบ (C1000TM ร้อน Cycler ไบโอ-Rad) ปฏิกิริยาทั้งหมดได้ดำเนินการโดยใช้ชุด SYBRH Premix ไป Taq II (Promega ประเทศจีน) ในมล 10รวมปริมาตรตัวอย่าง (5.0 ml 2 3 Taq ไป SYBR Premix ไพรเมอร์ 0.5 ml, cDNA 1.0 ml3.5 ml ddH2O) การเอาลักษณะพิเศษของ genomic DNA แม่แบบจากสิ่งแวดล้อม NTC (ไม่ควบคุมแม่) และ NRT (ไม่ควบคุม transcription ย้อนกลับ)ดำเนินการ ระยะที่สามสำหรับแต่ละตัวอย่างได้มาตรฐาน และใช้เส้นโค้งถูกเรียกใช้พร้อมกัน ละลายวิเคราะห์โค้ง qPCR ตัวอย่างเปิดเผยว่า มีผลิตภัณฑ์เพียงหนึ่งสำหรับแต่ละยีนพื้นปฏิกิริยา ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเรียงลำดับไปยืนยันขยายเฉพาะ ใช้เป็นมาตรฐานภายในยีน SlCAC58มะเขือเทศเนื้อเยื่อ ใช้ไพรเมอร์ SlFYFL (RT) - F และ SlFYFL (RT) - R (ตาราง S1)เพื่อกำหนดระดับการนิพจน์ของ SlFYFL ในป่าชนิดและถั่วเหลืองบรรทัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เชิงปริมาณแบบ real-time PCR วิเคราะห์ การสกัดอาร์เอ็นเอและการสังเคราะห์ cDNA ถูก
ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น cDNAs สังเคราะห์ถูกเจือจาง 1 ครั้งใน
RNase / น้ำ DNase ฟรี เชิงปริมาณแบบ real-time PCR วิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้
CFX96TM Real-Time System (C1000TM Cycler ความร้อนทางชีวภาพ -Rad) ปฏิกิริยาทั้งหมด
ได้รับการดำเนินการโดยใช้ชุด SYBRH พรีมิกซ์ไป Taq II (Promega, จีน) ใน 10 มิลลิลิตร
ปริมาณกลุ่มตัวอย่างทั้งหมด (5.0 มล 2 3 SYBR พรีมิกซ์ไป Taq 0.5 ไพรมิลลิลิตร 1.0 มล cDNA,
3.5 มล ddH2O) ในการลบผลกระทบของดีเอ็นเอและแม่แบบจาก
สภาพแวดล้อมที่กทช (ไม่มีการควบคุมแบบที่ใช้) NRT (ไม่มีการควบคุมการถอดความกลับ)
ได้ดำเนินการ สามซ้ำสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกนำมาใช้และเส้นโค้งมาตรฐาน
ได้ทำงานพร้อมกัน การวิเคราะห์เส้นโค้งละลายของตัวอย่าง qPCR เปิดเผยว่ามี
เพียงหนึ่งผลิตภัณฑ์สำหรับแต่ละปฏิกิริยาประถมศึกษายีน ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มีลำดับขั้นตอนในการ
ตรวจสอบการใช้เครื่องขยายเสียงที่เฉพาะเจาะจง ยีน SlCAC58 ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานภายใน
เนื้อเยื่อมะเขือเทศ ไพร SlFYFL (RT) -F และ SlFYFL (RT) -R (ตารางที่ S1) ถูกนำมาใช้
เพื่อกำหนดระดับการแสดงออกของ SlFYFL ในป่าประเภทและสายพันธุ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

PCR แบบเรียลไทม์การวิเคราะห์เชิงปริมาณ การสกัดและสังเคราะห์ cDNA ยีนถูก
ดำเนินการตามข้างต้นที่อธิบาย cdnas สังเคราะห์ลด 1 ครั้ง
น้ำเลส / ตรวจหา ADNase ฟรี การวิเคราะห์เชิงปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์ โดยใช้
cfx96tm เวลาจริงระบบ ( c1000tm Thermal cycler ชีวภาพราด ) เกิดปฏิกิริยา
ได้ใช้ sybrh พรีมิกซ์ไปแท็ค 2 ชุด ( promega จีน ) ใน 10 ml
ปริมาณตัวอย่างทั้งหมด ( 5.0 มิลลิลิตร 2 SYBR พรีมิกซ์ไปแท็ค 0.5 ml ไพรเมอร์ 1.0 มล. cDNA ,
3.5 ml ddh2o ) เอาผลของดีเอ็นเอและแม่แบบจาก
สิ่งแวดล้อม กทช ( ไม่ควบคุมแม่แบบ ) และ NRT ( ไม่ย้อนกลับถอดความควบคุม )
) แสดง สามซ้ำสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกใช้และ
เส้นโค้งมาตรฐานวิ่งพร้อมกันละลายการวิเคราะห์เส้นโค้งของตัวอย่าง พบว่า มี qpcr
เพียงผลิตภัณฑ์เดียวสำหรับแต่ละยีนสีปฏิกิริยา ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นลำดับ

ยืนยันแบบเฉพาะเจาะจง slcac58 ยีนที่ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายใน
เนื้อมะเขือเทศ ไพรเมอร์ slfyfl ( RT ) - F และ slfyfl ( RT ) - R ( ตาราง S1 ) ถูกใช้เพื่อกำหนดระดับของการแสดงออก
slfyfl ในประเภทป่าและสายพันธุกรรม .