Materials and MethodsIsolation and

Materials and Methods
Isolation and selection of thermotolerant meth- ylotrophic yeasts. Five strains of methylotrophic yeasts used in this study were obtained from flowers, tree flux and soil collected in Thailand (Table 1). The isolation was carried out by an enrichment technique using 1% (v/v) methanol-YNB broth (0.67% Difco- yeast nitrogen base and 1% (v/v) methanol) at room temperature for 4–5 days. After three consecutive en- richments, a loopful suspension was streaked on 1% (v/v) methanol-YNB agar and incubated for several days. Colonies with different morphologies were picked and then purified by the conventional streaking technique on YM agar. Growth at 37°C and 20°C on 1% (v/v) methanol-YNB agar was examined. Isolates that could grow at both temperatures were defined as thermotolerant methylotrophic yeasts. All isolates were stocked on YM agar slant at 4–8°C and in YM broth containing 10% glycerol at
80°C. Investigation of morphological, physiological and biochemical characteristics. The methylotrophic yeast strains were characterized morphologically, physiologically and biochemically by the standard methods described by Yarrow (1998). Assimilation of nitrogen compounds was examined on solid mediawith starved inocula following the method of Nakase and Suzuki (1986). The growth at various tempera- tures was determined by cultivation on YM agar and YM broth using incubators and water baths, respec- tively. Ubiquinone analysis. Cells were grown on a YPD agar plate at 28°C for 2 days and harvested by scrap- ing. Ubiquinones were extracted from intact packed cells and purified according to the method described by Nakase and Suzuki (1986). The isoprenologues were identified by HPLC using a Cosmosil (Waters 5C18) 4.6250mm column and methanol:isopropyl alcohol (2:1) at 1min/min as the elution system with spectrophotometric detection. rDNA sequencing and phylogenetic analysis. The sequences of the D1/D2 domain of 26S rDNA were determined by NCIMB Japan Co., Ltd., as follows. Cells used for DNA extraction were cultivated on a YM agar plate for 3 days at 30°C. DNA was isolated with the Fast DNA Kit (BIO101, La Jolla, CA, USA) and re- covered on a spin filter (BIO101). Both strands of the D1/D2 domain of the 26S rDNA were sequenced using the ABI Tag DyeDeoxy Terminator Cycle sequencing kit and an ABI PRISM® 377 automated DNA se- quencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). The sequences were compared pair-wise by BLAST homology search and aligned with the se- quences of related species using the multiple align- ment-program CLUSTAL W ver. 1.7 (Thompson et al., 1994). A phylogenetic tree was constructed from the evolutionary distance data according to the two-para- meter method of Kimura (1980) and the neighbor-join- ing method (Saitou and Nei, 1987). Confidence limits for phylogenetic tree were estimated from bootstrap analysis (1,000 replicates) (Felsenstein, 1985). The sequences determined in this study were deposited in the DDBJ database under the following accession numbers: FS96, AB120216; FS101T (TISTR 5818JCM 12264), AB120217; M02, AB120218; N051T (TISTR5820JCM 12266), AB120219 and S023T (TISTR 5821JCM 12265), AB120220.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ
แยกและตัวเลือก thermotolerant จาก ylotrophic yeasts สายพันธุ์ที่ห้าของ yeasts methylotrophic ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับมาจาก flowers, flux ต้นไม้และดินในประเทศไทย (ตารางที่ 1) แยกที่ถูกดำเนินการ โดยมีเทคนิคโดดเด่นใช้ซุป YNB เมทานอล 1% (v/v) (067% Difco ยีสต์ไนโตรเจนฐานและเมทานอล 1% (v/v)) ที่อุณหภูมิห้อง 4-5 วัน หลังจากที่สามติดต่อกันน้ำ-richments ระงับ loopful มีลายอยู่ 1% (v/v) เม YNB agar และ incubated หลายวัน อาณานิคมกับ morphologies แตกต่างกันได้รับเลือก และจากนั้น purified โดยที่ปกติ streaking เทคนิคใน YM agar เจริญเติบโตที่ 37° C 20° C ใน agar 1% (v/v) เมทานอล-YNB ถูกตรวจสอบ แยกที่สามารถเจริญเติบโตที่อุณหภูมิทั้งสองถูก defined เป็น thermotolerant methylotrophic yeasts แยกทั้งหมดถูกเก็บบนเอียง agar YM ที่ 4-8° C และซุป YM ประกอบด้วย 10% กลีเซอรที่ 80 องศาเซลเซียส การตรวจสอบลักษณะสัณฐาน สรีรวิทยา และชีวเคมี Methylotrophic ยีสต์มีลักษณะ morphologically, physiologically และ biochemically โดยวิธีมาตรฐานโดย Yarrow (1998) ผสมกลมกลืนของสารประกอบไนโตรเจนถูกตรวจสอบใน inocula starved mediawith แข็งตามวิธีของ Nakase และซูซูกิ (1986) การเติบโตที่อุณหภูมิ tures ต่าง ๆ ถูกกำหนด โดยปลูก YM agar และซุป YM ใช้ผลิตและน้ำอ่างอาบน้ำ respec-tively การวิเคราะห์ ubiquinone เซลล์ถูกพัฒนาบนจาน agar YPD ที่ 28° C 2 วัน และเก็บเกี่ยวผลผลิต โดยเสียกำลัง Ubiquinones ถูกสกัดจากเซลล์บรรจุเหมือนเดิมและ purified ตามวิธีการอธิบายไว้ โดย Nakase และซูซูกิ (1986) Isoprenologues ถูก identified โดย HPLC ใช้เป็น Cosmosil (น้ำ 5C 18) 4.6 250 มม.คอลัมน์และเมทานอล: isopropyl แอลกอฮอล์ (2:1) ใน 1 นาที/นาทีเป็นระบบ elution กับตรวจ spectrophotometric ลำดับ rDNA และวิเคราะห์ phylogenetic ลำดับของโดง 1/D2 ของ 26S rDNA ถูกกำหนด โดย NCIMB ญี่ปุ่น Co., ltd เป็นดังนี้ เซลล์ที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอถูก cultivated บนจาน YM agar สำหรับ 3 วันที่ 30 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอถูกแยก ด้วยเร็วดีเอ็นเอชุด (BIO101, La Jolla, CA, USA) และ re-ครอบคลุมในการหมุน filter (BIO101) ทั้งสอง strands ของโดง 1/D2 ของ 26S rDNA ถูกเรียงลำดับโดยใช้ชุดลำดับ ABI แท็ก DyeDeoxy เทอร์มิเนเตอร์วงจร และ DNA se-quencer (ประยุกต์ Biosystems, Inc. โดยอัตโนมัติเป็นปริซึม ABI ® 377 ฟอสเตอร์ City, CA, USA) ลำดับที่ได้เทียบ pair-wise ค้นหาระเบิด homology และสอดคล้องกับ se-quences พันธุ์ที่เกี่ยวข้องที่ใช้หลายตำแหน่งติดขัดโปรแกรม CLUSTAL W ไม่ 1.7 (ทอมป์สันและ al., 1994) ต้นไม้ phylogenetic ถูกสร้างจากข้อมูลระยะวิวัฒนาการตามวิธีสองพารามิเตอร์ของคิมุระโย (1980) และวิธีการใกล้เคียงรวม-ing (Saitou และ Nei, 1987) Confidence จำกัดสำหรับทรี phylogenetic ถูกประเมินจากการวิเคราะห์เริ่มต้นระบบ (เหมือนกับ 1000) (Felsenstein, 1985) ลำดับที่กำหนดในการศึกษานี้ได้ฝากในฐานข้อมูล DDBJ ภายใต้หมายเลขทะเบียนดังต่อไปนี้: FS96, AB120216 FS101T (วว 5818 JCM 12264), AB120217 M02, AB120218 N051T (TISTR5820 JCM 12266), AB120219 และ S023T (วว 5821 JCM 12265), AB120220.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ การแยกและคัดเลือกสารเมท - ylotrophic ยีสต์ 5 สายพันธุ์ของยีสต์ที่ methylotrophic ใช้ในการวิจัยได้จากflทาวเวอร์ ux fl , ต้นไม้และดินไทย ( ตารางที่ 1 ) การกระทำโดยการเสริมเทคนิคใช้ 1% ( v / v ) ส่วน ynb broth ( 067 % difco - เบสไนโตรเจนของยีสต์และ 1% ( v / v ) ส่วน ) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 - 5 วัน หลังจากที่สามติดต่อกันใน richments , loopful ช่วงล่างเป็นลายบน 1% ( v / v ) ส่วน ynb วุ้น และบ่มเป็นเวลาหลายวัน อาณานิคมโครงสร้างต่างกัน เลือกแล้ว ภูริจึงเอ็ดโดยทั่วไปเทคนิคในการ streaking วุ้นการเจริญเติบโตที่ 37 ° C และ 20 ° C ใน 1% ( v / v ) ส่วน ynb วุ้นถูกตรวจสอบ สายพันธุ์ที่สามารถเจริญเติบโตในอุณหภูมิที่ เดอ จึงเป็น methylotrophic เน็ดสารยีสต์ ทุกสายพันธุ์เป็น stocked บน YM วุ้นเอียงที่ 4 – 8 ° C และในการอาหารที่มีกลีเซอรอลที่ 10%
80 องศา การตรวจสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยา สรีรวิทยา และชีวเคมีสายพันธุ์ของยีสต์ methylotrophic มีลักษณะจากเรา biochemically , และโดยวิธีการมาตรฐานที่อธิบายโดยโรว์ ( 1998 ) การผสมผสานของสารประกอบไนโตรเจนที่ถูกตรวจสอบในของแข็ง mediawith หิว inocula ต่อไปนี้วิธีการ nakase และซูซูกิ ( 1986 )การเจริญเติบโตที่อุณหภูมิต่าง ๆ - ตูเรสถูกกำหนดจากการเพาะปลูกและการใช้น้ำในการใช้ตู้อบและน้ำอาบน้ำ respec - มี . การวิเคราะห์แผ่นได้ 14 . เซลล์ที่ปลูกบน ypd agar plate ที่ 28 ° C เป็นเวลา 2 วัน และเก็บเศษ - ไอเอ็นจี บิคควิโนนถูกสกัดจากเซลล์และปุริมจึงยังคงจัดตามวิธีการที่อธิบายโดย nakase และซูซูกิ ( 1986 )การ isoprenologues เป็น identi จึงเอ็ดโดย HPLC โดยใช้ cosmosil ( น้ำ 5c18 ) 4.6  คอลัมน์ : 250mm และเมทานอล isopropyl แอลกอฮอล์ ( 2 : 1 ) ใน 1 นาที / min ( ) เป็นระบบที่มีการตรวจสอบ ด้วยการวิเคราะห์ลำดับวิวัฒนาการ . ลำดับของ D1 / D2 โดเมนของ 26 ชนิดซึ่ง ncimb ญี่ปุ่น จำกัด ดังนี้เซลล์ที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอปลูกบน YM agar plate 3 วันที่ 30 องศา แยกดีเอ็นเอกับดีเอ็นเออย่างรวดเร็ว Kit ( bio101 , La Jolla , CA , USA ) และ re - ครอบคลุมในการปั่นจึง lter ( bio101 ) ทั้งเส้นของ D1 / D2 โดเมนของ 26 ชนิดเป็นลำดับการใช้อบิแท็ก dyedeoxy Terminator รอบลำดับชุดและ ABI ปริซึม® 377 อัตโนมัติดีเอ็นเอเซ - quencer ( Applied Biosystems )ฟอสเตอร์ซิตี , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ลำดับเปรียบเทียบปัญญาคู่ด้วยระเบิดที่มีการค้นหาและสอดคล้องกับ เซ - quences เกี่ยวข้องกับชนิดของการจัดโปรแกรมการ clustal หลาย W Ver . 1.7 ( Thompson et al . , 1994 )phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นจากข้อมูลระยะทางวิวัฒนาการตามสองพารา - มิเตอร์แบบคิมูระ ( 1980 ) และเพื่อนบ้านร่วม - วิธีไอเอ็นจี ( ไซโตะกับเนย , 1987 ) จำกัด dence จึงหลอกสำหรับการวิเคราะห์ phylogenetic ต้นไม้ประมาณได้จากบูท ( 1000 ซ้ำ ) ( felsenstein , 1985 )ผู้มุ่งมั่นในการศึกษา คือ เงินใน ddbj ฐานข้อมูลภายใต้ต่อไปนี้เข้าเลข fs96 ab120216 ; , fs101t ( วว. 5818  jcm 12264 ) ab120217 ; m02 ab120218 ; , n051t ( tistr5820  jcm ในการ ab120219 s023t ( วว. ) และ 5821  jcm 12265 ) ab120220 .