For determination of D1 and D3 acti

For determination of D1 and D3 activity, the release of [125Iodide] from [125I]-labeled substrates was measured using tissue or cell homogenates. The contribution of the mass of radioactive substrates added was taken into account for calculation of the total substrate concentrations. After the reaction, the [125I] iodide released was separated, by ion exchange chromatography, on Dowex 50W-X8 (100–200 μm pore size mesh; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)
columns, as previously described (Obregon et al., 1991; Hotz et al.,1996). Bicinchoninic acid assay (Pierce Chemical Co., Rockford, IL,USA) was employed for the determination of protein concentration. The following conditions were used for D1 and D3 activity assay. For D1: 20–30 μg protein was assayed with a final concentration of 0.1 μCi 125I-rT3 (North Institute of Biotechnology, Beijing, China) plus 500 nM unlabeled rT3 and 5 mM DTT, 1 mM EDTA in 0.1 M phosphate (pH
7.4) for 60 min at 37 °C. For D3: 30–50 μg protein with 0.1 μCi [3′-125I] T3 (North Institute of Biotechnology, Beijing, China) plus 50 nM unlabeled T3, 20 mM DTT, 2 mM EDTA, 0.1 mM PTU and 1 μM rT3 in
0.1 Mphosphate (pH 7.4) for 60 min at 37 °C. The enzyme activity was expressed as pmol 125I or fmol 125I released per minute per milligram of protein.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับการกำหนดกิจกรรมง 1 และดี 3 ปล่อยของ [125Iodide] จาก [125I] -พื้นผิวที่ป้ายถูกวัดโดยใช้เนื้อเยื่อหรือเซลล์ homogenates สัดส่วนของมวลของวัสดุกัมมันตรังสีที่เพิ่มถูกนำมาพิจารณาสำหรับการคำนวณความเข้มข้นรวมพื้นผิว หลังจากปฏิกิริยา ไอโอไดด์ [125I] ที่ออกถูกยอ สารกรอง chromatography บน Dowex 50W - X 8 (100 – 200 μm รูขุมขนขนาดตาข่าย Sigma-Aldrich, St Louis, MO สหรัฐอเมริกา)คอลัมน์ เป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Obregon et al., 1991 Hotz et al., 1996) Bicinchoninic วิเคราะห์กรด (เพียร์ซเคมี จำกัด ร็อคฟอร์ด IL สหรัฐอเมริกา) ถูกว่าจ้างสำหรับการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน เงื่อนไขต่อไปนี้ใช้สำหรับง 1 และดี 3 กิจกรรมวิเคราะห์ สำหรับง 1: 20 – 30 μg โปรตีนถูก assayed กับความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.1 μCi 125I-rT3 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพเหนือ ปักกิ่ง จีน) บวก 500 nM ไม่ rT3 และ 5 มม. DTT, 1 mM EDTA ในฟอสเฟต 0.1 M (pH7.4) ใน 60 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส สำหรับดี 3: 30 – 50 μg โปรตีนกับ 0.1 μCi [3′-125I] T3 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพเหนือ ปักกิ่ง จีน) บวก 50 nM ไม่ T3, 20 มม. DTT, 2 mM EDTA, ptu 0.1 mM และ 1 μM rT3 ใน0.1 Mphosphate (pH 7.4) ใน 60 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส เอนไซม์จะถูกแสดงเป็น pmol 125I หรือ fmol 125I ออกต่อนาทีต่อ milligram ของโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับการตัดสินใจของ D1 และกิจกรรม D3, การเปิดตัวของ [125Iodide] จาก [125i] พื้นผิว -labeled ถูกวัดโดยใช้ homogenates เนื้อเยื่อหรือเซลล์ ผลงานของมวลของพื้นผิวของสารกัมมันตรังสีที่เพิ่มถูกนำมาพิจารณาในการคำนวณความเข้มข้นของสารตั้งต้นรวม หลังจากปฏิกิริยาที่ [125i] ไอโอไดด์ที่ปล่อยออกมาถูกแยกออกโดยโคแลกเปลี่ยนไอออนใน Dowex 50W-X8 (100-200 ไมโครเมตรตาข่ายขนาดรูขุมขน; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)
คอลัมน์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Obregon et al, 1991;.. Hotz, et al, 1996) ทดสอบกรด Bicinchoninic (เพียร์ซ Chemical Co. , ฟอร์ด, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) ถูกจ้างสำหรับการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน เงื่อนไขต่อไปนี้ถูกนำมาใช้สำหรับ D1 และ D3 ทดสอบกิจกรรม สำหรับ D1: 20-30 ไมโครกรัมโปรตีนได้รับการวิเคราะห์ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.1 μCi 125i-RT3 (ภาคเหนือสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ, ปักกิ่ง, จีน) บวก 500 นาโนเมตรและไม่มีป้ายกำกับ RT3 5 มิลลิ DTT, EDTA 1 มิลลิใน 0.1 M ฟอสเฟต (pH
7.4 ) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สำหรับ D3: 30-50 ไมโครกรัมโปรตีน 0.1 μCi [3'-125i] T3 (ภาคเหนือสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ, ปักกิ่ง, จีน) บวก 50 นาโนเมตรที่ไม่มีป้ายกำกับ T3, 20 มิลลิ DTT 2 มิลลิ EDTA, 0.1 มิลลิ PTU 1 ไมครอน RT3 ใน
0.1 Mphosphate (pH 7.4) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส กิจกรรมของเอนไซม์ที่ได้รับการแสดงเป็น pmol 125i หรือ 125i fmol ปล่อยออกมาต่อนาทีต่อมิลลิกรัมของโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อกำหนดกิจกรรม D1 และ D3 , ปล่อย [ ] [ ] 125iodide 125I ติดพื้นผิวได้โดยใช้เนื้อเยื่อหรือเซลล์ homogenates . ส่วนของมวลของวัสดุกัมมันตรังสีเพิ่มถูกบัญชีเพื่อคำนวณความเข้มข้นตั้งต้นทั้งหมด หลังจากปฏิกิริยา [ 125I ] ไอโอไดด์ออกแยกโดยโครมาโตกราฟีแลกเปลี่ยนไอออนดังนั้นใน 50w-x8 ( 100 – 200 μ M ขนาดรูตาข่าย ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ , โม , USA )
คอลัมน์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ที่ตั้ง et al . , 1991 ; ฮ็อตส์ et al . , 1996 ) bicinchoninic กรด assay ( เพียร์ซ Chemical Co . , Rockford , IL , USA ) เป็นเครื่องมือในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน เงื่อนไขต่อไปนี้ใช้ใน D1 และ D3 กิจกรรมการทดสอบ สำหรับ D1 :20 – 30 μกรัมโปรตีนซีรั่มที่มีความเข้มข้นสุดท้าย 0.1 μ CI 125i-rt3 ( สถาบันทางชีวภาพ , ปักกิ่ง , จีน ) บวก 500 nm unlabeled rt3 ส่วน 5 มม. 1 mM EDTA ใน 0.1 M phosphate ( M
7.4 ) 60 นาทีที่ 37 องศา สำหรับ D3 : 30 – 50 μกรัม โปรตีน 0.1 μ CI [ 3 ’ - 125I ] T3 ( สถาบันทางชีวภาพ , ปักกิ่ง , จีน ) บวก 50 nm unlabeled T3 , DTT 20 mm , 2 mm EDTA , 0PTU 1 มม. และ 1 μ rt3 ใน 0.1 M
mphosphate ( pH 7.4 ) 60 นาทีที่ 37 ° C เอนไซม์จะแสดงเป็น pmol 125I หรือ fmol 125I ออกต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน