The DGGE analysis of partial nirS g

The DGGE analysis of partial nirS genes resulted in
only a few bands in all the environmental samples with
2–3 dense bands dominating in the middle of the gel
(Fig. 2a). This indicated that the resolution of the
DGGE was insufficient for the environmental nirS amplicons. To test the resolution, as well as primer specificity, almost all visible bands were cloned and
sequenced from the soil samples on the nirS gel as well
as four bands from the peat, all three bands from the
Kungs€ngen sludge sample and two of the three bands
a
from Henriksdal. Comparison with the NCBI database
using a BLAST search revealed that all 63 clones amplified with primers cd3aF:R3cd-GC showed homology
with known nirS sequences. The formation of heteroduplex DNA fragments was not detected in any of the
sequenced clones. All 31 bands except AS5, AS6, AS8
and US4 contained between two and six different clones,
which proves that the fragments did not separate to the
desired extent. The poor resolution could possibly be
due to the multiple melting domains observed in the
particular fragment. Multiple melting domains typically
result in fuzzy bands in the migration direction, ham-

Downloaded from http://femsec.oxfordjournals.org/ by guest on May 17, 2016

Five forward and six reverse nosZ primer candidates
were found (Table 3, Fig. 1c). For the nosZ primers,
Nos661F and Nos1773R, small modifications were tested but in Table 1 only the best result, which was from
the original primers, is shown. None of the nosZ primer
sets resulted in fragments from the non-denitrifying
strains. The best combination was shown to be primers
nosZ-F [18] and nosZ1622R, which was designed in the
present study. Together they amplified the correct
fragment in 25 of the 28 denitrifying bacterial strains
and in all environmental samples.
Kloos et al. [18] screened for nosZ in different Azospirillum strains and other plant growth-promoting rhizobacteria with the primers nosZ-F and nosZ-R. The
same primers were later used to investigate nosZ in an
acid forest soil [13] and meadow soil [29]. In our evaluation, the forward primer, nosZ-F, was combined with
the reverse primers nosZ-R, Nos1773R [16] and
nosZ1622R, with satisfactory results, but the combination nosZ-F:nosZ1622R gave even better results.
Nos661F and Nos1773R were the first primers targeting
nosZ [16], and were based on just a few sequences. They
were primarily used to amplify nosZ from marine sediments, but were recently used to survey nosZ in native
and cultivated soil [26]. Nogales et al. [17] modified these
primers (nosZ661b and nosZ1773b) to be more degenerate. However, none of the sets were successful in the
present re-evaluation. Ch?neby et al. [24] constructed
e
primers (nosLb and nosRb) for amplification of nosZ
genes in two agricultural soils. The primers were not
efficient in our study as shown by amplification of the
correct gene fragment from only nine of the pure cultures. The two primers (nosZf and nosZr) designed by
Delorme et al. [41] amplify a 1433-bp fragment and have
been used to specifically study genetic diversity in fluorescent pseudomonads in soil. This fragment is too long
for DGGE analysis but nosZf could be combined with
the nos661F target site to generate a 250-bp fragment.
However, since this re-evaluation has shown that
Nos661F is not suitable, nosZf was excluded from the
evaluation. Otherwise, the primer looks promising with
many conserved bases within the sequences. The nosZr
is located at the very end of the nosZ gene, from which
about 15 sequences are available. These sequences do
not appear to be very conserved and, therefore, it cannot
serve as a general nosZ primer.
All nosZ primer combinations, except nosLb:nosRb,
amplified a fragment of the correct size in the six environmental samples (Table 1) making all these sets
promising for community surveys. If other criteria for
evaluation of the primers are taken into account, such as
number of strains and genera that can be amplified, the
nosZ-F [18] in combination with nosZ1622R from this
study were the best. This set is also the only one yielding

amplicons of sufficient size both for community surveys
and for DGGE.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ DGGE ของยีน nirS บางส่วนส่งผลให้ใน
เพียงไม่กี่วงดนตรีในทุกตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อมที่มี
2-3 วงดนตรีที่มีอำนาจเหนือหนาแน่นในช่วงกลางของเจล
(รูป. 2A) นี้แสดงให้เห็นว่ามติของ
DGGE ถูก Insu ประสิทธิภาพ FFI สำหรับ amplicons nirS สิ่งแวดล้อม เพื่อทดสอบความละเอียดเช่นเดียวกับไพรเมอร์เมืองที่ระบุไว้เกือบวงดนตรีที่เห็นทั้งหมดถูกโคลนและ
ลำดับขั้นตอนจากตัวอย่างดินในเจล nirS เช่นเดียว
กับสี่วงดนตรีจากพรุทั้งสามวงดนตรีจาก
ตัวอย่างตะกอน Kungs € Ngen และสองของ สามวงจาก Henriksdal เปรียบเทียบกับฐานข้อมูล NCBI ใช้การค้นหาระเบิดเปิดเผยว่าทั้งหมด 63 โคลน ampli เอ็ด Fi ด้วยไพรเมอร์ cd3aF: R3cd-GC แสดงให้เห็นคล้ายคลึงกันกับลำดับ nirS ที่รู้จักกัน การก่อตัวของ heteroduplex ดีเอ็นเอไม่พบในใด ๆ ของโคลนติดใจ ทั้งหมด 31 วงดนตรีที่ยกเว้น AS5, AS6, AS8 และ US4 มีอยู่ระหว่างสองและหก di โคลน FF ต่างกัน, ซึ่งพิสูจน์ให้เห็นว่าเศษไม่ได้แยกออกไปในระดับที่ต้องการ ความละเอียดที่ไม่ดีอาจจะเกิดจากการละลายหลายโดเมนพบในชิ้นส่วนโดยเฉพาะอย่างยิ่ง โดเมนละลายหลายมักจะส่งผลในวงดนตรีที่เลือนไปในทิศทางโยกย้าย ham- ดาวน์โหลดจาก http://femsec.oxfordjournals.org/ โดยผู้เข้าพักเมื่อ 17 พฤษภาคม 2016 ห้าไปข้างหน้าและย้อนกลับหก nosZ ผู้สมัครไพรเมอร์ถูกพบ (ตารางที่ 3 รูป 1C) ไพรเมอร์สำหรับ nosZ, Nos661F และ Nos1773R, Modi เล็กไพเพอร์ Fi ได้รับการทดสอบ แต่ในตารางที่ 1 เพียง แต่ผลที่ดีที่สุดซึ่งมาจากไพรเมอร์เดิมที่จะแสดง ไม่มี nosZ ไพรเมอร์ชุดส่งผลให้เศษจากที่ไม่ใช่ Denitrifying สายพันธุ์ ชุดที่ดีที่สุดคือการแสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์nosZ-F [18] และ nosZ1622R ซึ่งได้รับการออกแบบในการศึกษาปัจจุบัน พวกเขาช่วยกัน ampli Fi เอ็ดที่ถูกต้องออกเป็นชิ้น ๆ ใน 25 ของ 28 Denitrifying แบคทีเรียและในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม. Kloos et al, [18] การตรวจคัดกรองใน nosZ di FF ต่างกันสายพันธุ์ Azospirillum และโรงงาน rhizobacteria ส่งเสริมการเจริญเติบโตอื่น ๆ ที่มีไพรเมอร์ nosZ-F และ nosZ-วิจัย ไพรเมอร์เดียวกันถูกนำมาใช้ในภายหลังเพื่อตรวจสอบ nosZ ในดินป่ากรด [13] และทุ่งหญ้าดิน [29] ในการประเมินผลของเราไพรเมอร์ไปข้างหน้า nosZ-F, ได้ร่วมกับไพรเมอร์กลับ nosZ-R Nos1773R [16] และnosZ1622R กับผลลัพธ์ที่น่าพอใจ แต่รวมกัน nosZ-F:. nosZ1622R ให้ผลดียิ่งขึ้นNos661F และ Nos1773R อยู่ ไพรเมอร์แรกกำหนดเป้าหมายnosZ [16] และอยู่บนพื้นฐานเพียงไม่กี่ลำดับ พวกเขาถูกนำมาใช้เป็นหลักในการขยาย nosZ จากตะกอนทะเล แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ถูกนำมาใช้เพื่อสำรวจ nosZ ในประเทศและได้รับการปลูกฝังดิน [26] Nogales et al, [17] Modi Fi เอ็ดเหล่าไพรเมอร์ (nosZ661b และ nosZ1773b) จะเป็นคนเลวมากขึ้น แต่ไม่มีชุดที่ประสบความสำเร็จในปัจจุบันการประเมิน Ch? Neby et al, [24] สร้างE ไพรเมอร์ (nosLb และ nosRb) สำหรับไอออนบวก Fi ampli ของ nosZ ยีนในสองดินเกษตร ไพรเมอร์ไม่ได้e FFI ประสิทธิภาพในการศึกษาของเราที่แสดงโดยไอออนบวก Fi ampli ของชิ้นส่วนของยีนที่ถูกต้องจากเพียงเก้าของเชื้อบริสุทธิ์ ทั้งสองไพรเมอร์ (nosZf และ nosZr) ออกแบบโดยDelorme et al, [41] ขยายส่วน 1433-BP และได้ถูกนำมาใช้เพื่อความหลากหลายทางพันธุกรรม speci Fi ถอนรากถอนโคนการศึกษาในชั้น uorescent pseudomonads ในดิน ชิ้นส่วนนี้ยาวเกินไปสำหรับการวิเคราะห์ DGGE แต่ nosZf สามารถใช้ร่วมกับเว็บไซต์เป้าหมาย nos661F ในการสร้างชิ้นส่วน 250 bp. อย่างไรก็ตามตั้งแต่นี้การประเมินแสดงให้เห็นว่าNos661F ไม่เหมาะสม nosZf ได้รับการยกเว้นจากการประเมินผล มิฉะนั้นไพรเมอร์ที่มีลักษณะที่มีแนวโน้มที่มีฐานการอนุรักษ์จำนวนมากภายในลำดับ nosZr ตั้งอยู่ที่ปลายสุดของยีน nosZ จากที่ประมาณ 15 ลำดับที่มีอยู่ ลำดับเหล่านี้จะไม่ปรากฏว่าได้รับการอนุรักษ์มากและจึงไม่สามารถทำหน้าที่เป็น nosZ ไพรเมอร์ทั่วไป. ทั้งหมด nosZ รวมกันไพรเมอร์ยกเว้น nosLb: nosRb, ampli Fi เอ็ดส่วนของขนาดที่ถูกต้องในตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อมหก (ตารางที่ 1) ทำให้ทุก ชุดนี้มีแนวโน้มสำหรับการสำรวจชุมชน หากมีเงื่อนไขอื่น ๆ สำหรับการประเมินผลของไพรเมอร์ถูกนำเข้าบัญชีเช่นจำนวนของสายพันธุ์และจำพวกที่สามารถเอ็ด Fi ampli ที่nosZ-F [18] ร่วมกับ nosZ1622R จากนี้การศึกษาได้ดีที่สุด ชุดนี้ยังเป็นเพียงคนเดียวที่ให้ผลผลิตamplicons ขนาด Su FFI ประสิทธิภาพทั้งสำหรับการสำรวจชุมชนและ DGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในการทดลองการวิเคราะห์ยีนก่อให้เกิด nirs บางส่วนเพียงไม่กี่วง ในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม2 – 3 หนาแน่นแถบทั้งหมด ในช่วงกลางของเจล( รูปที่ 2A ) นี้แสดงให้เห็นว่า ความละเอียดของการทดลองคือมีฉนวนffi cient สำหรับ nirs สิ่งแวดล้อม amplicons . เพื่อทดสอบความละเอียดเช่นเดียวกับไพรเมอร์กาจึงมองเห็นเมือง วงเกือบทั้งหมดถูกโคลนและลำดับจากตัวอย่างดินใน nirs เจลเช่นกันเป็นสี่วงจากพีท ทั้งสามวงจากด้านเงิน kungs ตะกอนตัวอย่างและสองของ 3 วงเป็นจาก henriksdal . การเปรียบเทียบกับ ncbi ฐานข้อมูลการค้นหาทั้งหมด 63 ระเบิดพบว่าโคลน ampli จึงเอ็ดกับไพรเมอร์ cd3af : r3cd GC แสดงลำดับทราบ nirs ลำดับ การก่อตัวของ heteroduplex ดีเอ็นเอไม่พบในใด ๆของยีนโคลนนิ่ง ทั้งหมด 31 วงยกเว้น as5 as6 as8 , ,US4 ที่มีอยู่ระหว่างสองและหกและดิ ff erent โคลนซึ่งพิสูจน์ได้ว่าชิ้นส่วนไม่ได้แยกไปขอบเขตที่ต้องการ ความละเอียดจนอาจจะเนื่องจากหลายโดเมนที่พบในการหลอมโดยเฉพาะส่วน . หลายโดเมนมักจะละลายผลในแถบเลือนในการย้ายถิ่นแฮม - ทิศทางดาวน์โหลดได้จาก http://femsec.oxfordjournals.org/ แขก 17 พฤษภาคม 2016ห้าและหกย้อนกลับไปข้างหน้า nosz ไพรเมอร์ ผู้สมัคร( ตารางที่ 3 ) พบว่า ภาพที่ 1c ) สำหรับ nosz ไพรเมอร์ ,และ nos661f nos1773r ขนาดเล็กจึงทำให้ Modi ทดสอบแต่ในตารางที่ 1 เท่านั้น ซึ่งจากผลไพรเมอร์เดิมแสดง ไม่มีของ nosz ไพรเมอร์ชุด ส่งผลให้ชิ้นส่วนจากนอกดีไนตริฟายอิงสายพันธุ์ ชุดที่ดีที่สุดคือ แสดงเป็น ไพรเมอร์nosz-f [ 18 ] และ nosz1622r ซึ่งถูกออกแบบในการศึกษาปัจจุบัน ร่วมกันพวกเขา ampli จึงเอ็ดถูกต้องในส่วนของ 28 สายพันธุ์แบคทีเรียดีไนตริฟายอิง 25และในตัวอย่างสิ่งแวดล้อมทั้งหมดkloos et al . [ 18 ] จาก nosz ใน ff erent โซ ปริลลัม สายพันธุ์ และอื่น ๆที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตไรโซแบคทีเรียด้วยไพรเมอร์และการ nosz-f nosz-r.ชนิดเดียวกันถูกใช้ในภายหลังเพื่อตรวจสอบ nosz ในดินกรด [ 13 ] และทุ่งหญ้า ป่าดิน [ 29 ] ในการประเมินผลของเราไปข้างหน้าก่อน , nosz-f ถูกรวมกับกลับจาก nosz-r nos1773r [ 16 ] , และnosz1622r ที่มีผลที่น่าพอใจ แต่การรวมกัน nosz-f : nosz1622r ให้ผลลัพธ์ที่ดียิ่งขึ้นและ nos661f nos1773r ได้จึงตัดสินใจเดินทางจากเป้าหมายnosz [ 16 ] และจากเพียงไม่กี่ลำดับ พวกเขาถูกใช้เป็นหลักในการขยาย nosz จากตะกอนพื้นทะเล แต่ถูกใช้เมื่อเร็ว ๆ นี้ เพื่อสำรวจ nosz ในพื้นเมืองปลูกในดิน [ 26 ] โนกาเลส et al . [ 17 ] Modi จึงเอ็ดเหล่านี้ไพรเมอร์ ( nosz661b และ nosz1773b ) จะเสื่อมสภาพ เพิ่มเติม แต่ไม่มีชุดสำเร็จในการประเมินอีกครั้งปัจจุบัน ชอนฮี ? neby et al . [ 24 ] สร้างขึ้นอีไพรเมอร์ ( noslb และ nosrb ) จึง ampli ไอออนบวกของ noszยีนใน 2 เกษตรดิน ด้วยไม่ได้E ffi cient ในการศึกษาของเราที่แสดงโดย ampli จึงบวกของส่วนยีน ที่ถูกต้องจาก เก้า ของวัฒนธรรมบริสุทธิ์ สองชนิด ( noszf และ noszr ) ออกแบบโดยลอร์ม et al . [ 41 ] ขยายขนาด 1433 BP และมีถูกใช้เพื่อกาศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมในflคอลลี่จึง uorescent pseudomonads ในดิน ส่วนนี้จะยาวเกินไปการวิเคราะห์การทดลองแต่ noszf สามารถรวมกับการ nos661f เป้าหมายเว็บไซต์เพื่อสร้างขนาด 250 บีพีอย่างไรก็ตาม , ตั้งแต่นี้จะประเมินผลพบว่าnos661f ไม่เหมาะสม noszf ถูกแยกออกจากการประเมินผล มิฉะนั้น รองพื้นดูสดใสด้วยหลายปี ฐานภายใน ลำดับ การ noszrตั้งอยู่ที่ส่วนท้ายสุดของ nosz ยีนจากที่เกี่ยวกับ 15 ลำดับ พร้อมใช้งาน ลำดับเหล่านี้ทำไม่ปรากฏว่าเป็นป่าสงวนและ ดังนั้น จึงไม่สามารถใช้เป็นสีรองพื้น nosz ทั่วไปnosz ผสมรองพื้นทั้งหมด ยกเว้น nosrb noslb : ,ampli จึงเอ็ดส่วนของขนาดที่ถูกต้องในหกสิ่งแวดล้อมตัวอย่าง ( ตารางที่ 1 ) การตั้งค่าทั้งหมดเหล่านี้สัญญาสำหรับการสำรวจชุมชน ถ้าเงื่อนไขอื่น ๆการประเมินผลของไพรเมอร์จะพิจารณา เช่นจำนวนของสายพันธุ์และสกุลที่สามารถ ampli จึงเอ็ด ,nosz-f [ 18 ] ในการรวมกันกับ nosz1622r จากเรียนเก่งที่สุด ชุดนี้ยังเป็นเพียงหนึ่งในผลผลิตamplicons ขนาดซูffi cient ทั้งการสำรวจชุมชนและสำหรับการทดลอง .