- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Screening of Enteric Bacteria Capab
Screening of Enteric Bacteria Capable of Hydrolyzing EGCg.
After sterilization of 9 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.1) by
autoclaving at 121 C for 15 min, EGCg solution (1 mL, 10 mg/mL)
filtered through sterilized membrane filter DISMIC-25cs, 0.2 μm (Toyo
Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan) was added to the buffer. Each bacterial
strain (22 genera, 169 strains) was inoculated to the solution and then 2 mL
of sterile mineral oil was layered over. The mixture was incubated at 37 C
for 24 h and then was centrifuged at 3500g for 10 min at room temperature.
The supernatant was analyzed by HPLC to select the enterobacteria with
the ability to hydrolyze EGCg. Analytical HPLC was carried out with a
250 4.6 mm i.d., 5 μm, Capcell Pak C18 UG120 (Shiseido Co. Ltd.,
Tokyo, Japan) in an Waters 2695 Separations Module (Nihon Waters,
Tokyo, Japan) apparatus equipped with an Waters 2489 UV/VS Detector
(270 nm). Elution was done with distilled water/methanol/acetonitrile/
phosphoric acid (85/10/5/0.01, v/v/v/v) at a flow rate of 1 mL/min at 40 C.
Time-Course Analysis of the Metabolite Formation from EGC
(1) by Rat Intestinal Flora. Incubation method of EGC with rat
enterobacteria was done according to that of Meselhy et al. (22). Fresh
cecal contents (3.3 g) obtained from three male Wistar rats (16 weeks of
age) were put into 300 mL of GAM broth and then incubated at 37 C
under anaerobic condition with an Anaeropack system (Mitsubishi Gas
Chemical, Tokyo, Japan). After 3 days, the culture was centrifuged by
Avanti J-25 (Beckman Coulter, Tokyo, Japan) at 15000g for 20 min at
4 C, and the harvested cells were washed once with sterile water (200 mL).
The cells were suspended in 150 mL of prefiltered 0.1 M phosphate buffer
(pH 7.1), and 200 mg of EGC in 20 mL of 5% aqueous methanol
prefiltrated with the sterilized membrane filter was added to the cell
suspension. The mixture was incubated under anaerobic condition with
the Anaeropack system. After incubation for 24, 48, 72, 96, and 168 h,
aliquots (1 mL) of the incubation mixture were withdrawn in an anaerobic
glovebox under CO2 atmosphere. These samples were centrifuged by MX-
301 centrifuge (TOMY Seiko, Tokyo, Japan) at 15000g for 10 min at 4 C.
The resulting supernatants were filtered with the membrane filter and then
analyzed by Surveyor HPLC and LCQ Deca XPplus system (Thermo
Fisher Scientific, USA). The above experiment was repeated more than 15
times with different cecal contents of different rats (15-21 weeks).
Purification of EGC Metabolites. The metabolite formation from
EGC by rat intestinal flora was performed according to the procedure as
described above. After incubation for 24, 48, and 96 h, 50 mL each samples
of the incubation mixture were taken out in the anaerobic glovebox. Each
sample was centrifuged at 15000g for 20 min at 4 C to remove bacterial
cells. The resulting supernatant was adjusted pH to about 3.5 with 5 M
HCl and then extracted three times with equal volume of ethyl acetate. The
ethyl acetate fraction was evaporated to dryness under reduced pressure.
The residue obtained from the 24-h incubation mixture was used for the
isolation of 3 and 8, and the residue from the 48-h mixture for 4. Similarly,
the isolation of 5 to 7 was performed with the 96-h incubation mixture.
Each residue obtained from the 24- and 48-h incubation mixtures were
dissolved in 3 mL of 5% aqueous methanol and the solution was subjected
to preparative HPLC for purification of 3, 4, and 8. Preparative HPLC was
performed with a 150 mm 20 mm i.d., 5 μm, Capcellpak C18 MG
column (Shiseido Co. Ltd., Tokyo, Japan) in a JASCO HPLC 800 series
system (JASCO, Tokyo, Japan). The column was eluted with a linear
gradient of solvent, starting with 10% (v/v) methanol aqueous solution
containing 0.5% (v/v) acetic acid and ending with 60% (v/v) aqueous
methanol containing 0.5% (v/v) acetic acid at a flow rate of 9.7 mL/min at
40 C. The elution pattern was monitored by measuring the absorbance at
270 nm. Each fraction containing metabolite was collected and evaporated
to dryness. The residue was dissolved in 5 mL of distilled water and then
concentrated to dryness. This procedure was repeated two more times to
remove acetic acid completely. The resultant residues were individually
dissolved in a small amount of distilled water and freeze-dried to obtain
metabolite 3 (17 mg), metabolite 4 (15 mg), and metabolite 8 (5 mg). For
the isolation of 5 to 7, the ethyl acetate fraction obtained from the 96-h
incubation mixture was extracted with the one-fifth volume of 20 mM
aqueous Na2CO3 solution. In this process, 6 remained in the organic layer,
and 5 and 7 were distributed in the aqueous layer. Metabolite 6 in the ethyl
acetate fraction was purified in the same manner as was metabolite 3 to
obtain 5 mg of purified 6. The aqueous solution containing 5 and 7 was
evaporated to about 5 mL, and the concentrate was adjusted to around pH
5.0 with 5 M acetic acid. After removal of the precipitate (probably sodium
acetate) by centrifugation, the supernatant was subjected to preparative
HPLC. The HPLC were performed under the same conditions as described
above except for using mobile phases without acetic acid. Metabolite 7
fraction was evaporated under reduced pressure and then freeze-dried to
obtain purified metabolite 7 (3 mg). On the other hand, 5 fraction was
concentrated to remove the organic solvents and the resulting concentrate
was applied to an ion exchange column 10 65 mm, 5.1 mL of Diaion
SK1B Naþ form (Mitsubishi Chemical, Co., Tokyo, Japan) which had
been equilibrated with distilled water. The column was eluted with 5 vol of
distilled water. The eluate was concentrated to about 3 mL and then
lyophilized to obtain 21 mg of metabolite 5 as sodium salt.
When different intestinal flora was used, metabolites 9-12 were formed
from EGC in addition to 3, 5, and 6 (Figure 2A). Then, the 24-h incubation
mixture for the isolation of 9 and 10 was adjusted pH to 1.5 with 5 M
phosphoric acid and the metabolites were extracted three times with same
volume of a mixture of ethyl acetate/n-butanol (1/1, v/v). The organic layer
was then treated two times with half volume of 100 mM aqueous Na2CO3
containing 0.1% sodium ascorbate. In this procedure, 9 passed into the
aqueous layer, while 10 remained in the organic layer. The aqueous layer
was adjusted to around pH 7.0 with 5 M HCl and was concentrated to
about 15 mL. To the concentrate 75 mL of ethanol was added and then it
was centrifuged to remove insoluble material. The supernatant was
concentrated to 1 mL and then the concentrate was adjusted to pH 2-3
with 2 M HCl and subjected to preparative HPLC. The HPLC conditions
were the same as for metabolite 5 as mentioned above. Metabolite 9
fraction was collected and concentrated to remove organic solvent. The
resultant solution was treated with the Diaion SK1B Naþ form column in
the same manner as for 5. The eluate was concentrated and lyophilized to
obtain 5 mg of purified 9. The ethyl acetate-n-butanol layer containing 10
was concentrated to dryness. The resultant residue was treated in the same
manner as was 3 to obtain 3 mg of purified 10. Metabolites 11 and 12 were
purified from 72-h and 168-h incubation mixtures, respectively, using the
same procedure as for 3. Finally, 10 mg of 11 and 19 mg of 12 were
obtained. Metabolite 13 was also transformed from EGC by other rat
intestinal flora (Figure 2B). This compound was also purified from 24-h
incubation mixture using the same procedure as for 11 to obtain 8 mg of
purified 13.
In
After sterilization of 9 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.1) by
autoclaving at 121 C for 15 min, EGCg solution (1 mL, 10 mg/mL)
filtered through sterilized membrane filter DISMIC-25cs, 0.2 μm (Toyo
Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan) was added to the buffer. Each bacterial
strain (22 genera, 169 strains) was inoculated to the solution and then 2 mL
of sterile mineral oil was layered over. The mixture was incubated at 37 C
for 24 h and then was centrifuged at 3500g for 10 min at room temperature.
The supernatant was analyzed by HPLC to select the enterobacteria with
the ability to hydrolyze EGCg. Analytical HPLC was carried out with a
250 4.6 mm i.d., 5 μm, Capcell Pak C18 UG120 (Shiseido Co. Ltd.,
Tokyo, Japan) in an Waters 2695 Separations Module (Nihon Waters,
Tokyo, Japan) apparatus equipped with an Waters 2489 UV/VS Detector
(270 nm). Elution was done with distilled water/methanol/acetonitrile/
phosphoric acid (85/10/5/0.01, v/v/v/v) at a flow rate of 1 mL/min at 40 C.
Time-Course Analysis of the Metabolite Formation from EGC
(1) by Rat Intestinal Flora. Incubation method of EGC with rat
enterobacteria was done according to that of Meselhy et al. (22). Fresh
cecal contents (3.3 g) obtained from three male Wistar rats (16 weeks of
age) were put into 300 mL of GAM broth and then incubated at 37 C
under anaerobic condition with an Anaeropack system (Mitsubishi Gas
Chemical, Tokyo, Japan). After 3 days, the culture was centrifuged by
Avanti J-25 (Beckman Coulter, Tokyo, Japan) at 15000g for 20 min at
4 C, and the harvested cells were washed once with sterile water (200 mL).
The cells were suspended in 150 mL of prefiltered 0.1 M phosphate buffer
(pH 7.1), and 200 mg of EGC in 20 mL of 5% aqueous methanol
prefiltrated with the sterilized membrane filter was added to the cell
suspension. The mixture was incubated under anaerobic condition with
the Anaeropack system. After incubation for 24, 48, 72, 96, and 168 h,
aliquots (1 mL) of the incubation mixture were withdrawn in an anaerobic
glovebox under CO2 atmosphere. These samples were centrifuged by MX-
301 centrifuge (TOMY Seiko, Tokyo, Japan) at 15000g for 10 min at 4 C.
The resulting supernatants were filtered with the membrane filter and then
analyzed by Surveyor HPLC and LCQ Deca XPplus system (Thermo
Fisher Scientific, USA). The above experiment was repeated more than 15
times with different cecal contents of different rats (15-21 weeks).
Purification of EGC Metabolites. The metabolite formation from
EGC by rat intestinal flora was performed according to the procedure as
described above. After incubation for 24, 48, and 96 h, 50 mL each samples
of the incubation mixture were taken out in the anaerobic glovebox. Each
sample was centrifuged at 15000g for 20 min at 4 C to remove bacterial
cells. The resulting supernatant was adjusted pH to about 3.5 with 5 M
HCl and then extracted three times with equal volume of ethyl acetate. The
ethyl acetate fraction was evaporated to dryness under reduced pressure.
The residue obtained from the 24-h incubation mixture was used for the
isolation of 3 and 8, and the residue from the 48-h mixture for 4. Similarly,
the isolation of 5 to 7 was performed with the 96-h incubation mixture.
Each residue obtained from the 24- and 48-h incubation mixtures were
dissolved in 3 mL of 5% aqueous methanol and the solution was subjected
to preparative HPLC for purification of 3, 4, and 8. Preparative HPLC was
performed with a 150 mm 20 mm i.d., 5 μm, Capcellpak C18 MG
column (Shiseido Co. Ltd., Tokyo, Japan) in a JASCO HPLC 800 series
system (JASCO, Tokyo, Japan). The column was eluted with a linear
gradient of solvent, starting with 10% (v/v) methanol aqueous solution
containing 0.5% (v/v) acetic acid and ending with 60% (v/v) aqueous
methanol containing 0.5% (v/v) acetic acid at a flow rate of 9.7 mL/min at
40 C. The elution pattern was monitored by measuring the absorbance at
270 nm. Each fraction containing metabolite was collected and evaporated
to dryness. The residue was dissolved in 5 mL of distilled water and then
concentrated to dryness. This procedure was repeated two more times to
remove acetic acid completely. The resultant residues were individually
dissolved in a small amount of distilled water and freeze-dried to obtain
metabolite 3 (17 mg), metabolite 4 (15 mg), and metabolite 8 (5 mg). For
the isolation of 5 to 7, the ethyl acetate fraction obtained from the 96-h
incubation mixture was extracted with the one-fifth volume of 20 mM
aqueous Na2CO3 solution. In this process, 6 remained in the organic layer,
and 5 and 7 were distributed in the aqueous layer. Metabolite 6 in the ethyl
acetate fraction was purified in the same manner as was metabolite 3 to
obtain 5 mg of purified 6. The aqueous solution containing 5 and 7 was
evaporated to about 5 mL, and the concentrate was adjusted to around pH
5.0 with 5 M acetic acid. After removal of the precipitate (probably sodium
acetate) by centrifugation, the supernatant was subjected to preparative
HPLC. The HPLC were performed under the same conditions as described
above except for using mobile phases without acetic acid. Metabolite 7
fraction was evaporated under reduced pressure and then freeze-dried to
obtain purified metabolite 7 (3 mg). On the other hand, 5 fraction was
concentrated to remove the organic solvents and the resulting concentrate
was applied to an ion exchange column 10 65 mm, 5.1 mL of Diaion
SK1B Naþ form (Mitsubishi Chemical, Co., Tokyo, Japan) which had
been equilibrated with distilled water. The column was eluted with 5 vol of
distilled water. The eluate was concentrated to about 3 mL and then
lyophilized to obtain 21 mg of metabolite 5 as sodium salt.
When different intestinal flora was used, metabolites 9-12 were formed
from EGC in addition to 3, 5, and 6 (Figure 2A). Then, the 24-h incubation
mixture for the isolation of 9 and 10 was adjusted pH to 1.5 with 5 M
phosphoric acid and the metabolites were extracted three times with same
volume of a mixture of ethyl acetate/n-butanol (1/1, v/v). The organic layer
was then treated two times with half volume of 100 mM aqueous Na2CO3
containing 0.1% sodium ascorbate. In this procedure, 9 passed into the
aqueous layer, while 10 remained in the organic layer. The aqueous layer
was adjusted to around pH 7.0 with 5 M HCl and was concentrated to
about 15 mL. To the concentrate 75 mL of ethanol was added and then it
was centrifuged to remove insoluble material. The supernatant was
concentrated to 1 mL and then the concentrate was adjusted to pH 2-3
with 2 M HCl and subjected to preparative HPLC. The HPLC conditions
were the same as for metabolite 5 as mentioned above. Metabolite 9
fraction was collected and concentrated to remove organic solvent. The
resultant solution was treated with the Diaion SK1B Naþ form column in
the same manner as for 5. The eluate was concentrated and lyophilized to
obtain 5 mg of purified 9. The ethyl acetate-n-butanol layer containing 10
was concentrated to dryness. The resultant residue was treated in the same
manner as was 3 to obtain 3 mg of purified 10. Metabolites 11 and 12 were
purified from 72-h and 168-h incubation mixtures, respectively, using the
same procedure as for 3. Finally, 10 mg of 11 and 19 mg of 12 were
obtained. Metabolite 13 was also transformed from EGC by other rat
intestinal flora (Figure 2B). This compound was also purified from 24-h
incubation mixture using the same procedure as for 11 to obtain 8 mg of
purified 13.
In
0/5000
การคัดกรองของแบคทีเรียสามารถ Hydrolyzing EGCg Entericหลังจากฆ่าเชื้อโรค 9 mL 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.1) โดยautoclaving ที่ 121 C สำหรับ 15 นาที โซลูชัน EGCg (1 mL, 10 mg/mL)กรองผ่านตัวกรองเมมเบรน sterilized DISMIC-25cs, μm 0.2 (โตโยRoshi Kaisha จำกัด โตเกียว ญี่ปุ่น) ถูกเพิ่มไปยังบัฟเฟอร์ แบคทีเรียแต่ละต้องใช้ (22 สกุล สายพันธุ์ 169) ถูก inoculated การแก้ปัญหา แล้ว 2 mLใส่น้ำมันแร่เป็นชั้นมากกว่า ส่วนผสมคือ incubated ที่ 37 Cใน 24 ชมแล้ว ถูก centrifuged ที่ 3500g ใน 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องSupernatant ถูกวิเคราะห์ ด้วย HPLC เพื่อเลือก enterobacteria ด้วยความสามารถในการ hydrolyze EGCg วิเคราะห์ HPLC ถูกดำเนินการด้วยการประชาชน 4.6 มม. 250, μm 5, UG120 C18 ปาก Capcell (อาชิเซโด้ จำกัดโตเกียว ญี่ปุ่น) ในโมดูประโยชน์น้ำ 2695 (นิน้ำโตเกียว ญี่ปุ่น) เครื่องมือที่เพียบพร้อมไป ด้วยเครื่องตรวจจับ UV/VS น้ำ 2489 การ(270 nm) Elution ทำกับกลั่นน้ำ/เมทานอ ล/acetonitrile /กรดฟอสฟอริก (85/10/5/0.01, v/v/v/v) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาทีที่ 40 เซลเซียสวิเคราะห์หลักสูตรเวลาการก่อตัวของ Metabolite จาก EGC(1) โดยพืชลำไส้หนู วิธีการบ่มของ EGC กับหนูenterobacteria เสร็จตามที่ของ Meselhy et al. (22) สดcecal เนื้อหา (3.3 g) ได้จากสามชายหนู Wistar (16 สัปดาห์ของอายุ) บรรจุ 300 mL ของ GAM ซุป และ incubated ที่ 37 C แล้วภายใต้เงื่อนไขไม่ใช้กับระบบ Anaeropack (มิตซูบิชิแก๊สเคมี โตเกียว ญี่ปุ่น) หลังจาก 3 วัน วัฒนธรรมถูก centrifuged โดยเรียนโรส J-25 (Beckman Coulter โตเกียว ญี่ปุ่น) ที่ 15000g สำหรับ 20 นาทีที่4 C และเซลล์ harvested ถูกล้างเมื่อใส่น้ำ (200 มล.)เซลล์ถูกหยุดชั่วคราวใน 150 mL บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M prefiltered(pH 7.1), และ 200 มิลลิกรัมของ EGC ใน 20 มล.ของ 5% เมทานอลอควีprefiltrated กับเมมเบรน sterilized เพิ่มตัวกรองไปยังเซลล์ระบบกันสะเทือน ส่วนผสมที่ incubated ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนด้วยระบบ Anaeropack หลังจากฟักตัวใน 24, 48, 72, 96 และ 168 haliquots (1 mL) ของผสมบ่มถูกถอนในการไม่ใช้ออกซิเจนglovebox ภายใต้บรรยากาศ CO2 ตัวอย่างเหล่านี้ถูก centrifuged โดย MX-301 เครื่องหมุนเหวี่ยง (TOMY Seiko โตเกียว ญี่ปุ่น) ที่ 15000g ใน 10 นาทีที่ 4 คSupernatants ได้ถูกกรองกับตัวกรองเมมเบรนแล้ววิเคราะห์ระบบ HPLC เมเนจเมนท์และ LCQ เดกา XPplus (เทอร์โมFisher วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) การทดลองข้างต้นถูกซ้ำมากกว่า 15เวลา มีเนื้อหาแตกต่างกัน cecal ของหนูแตกต่างกัน (15-21 สัปดาห์)ทำให้บริสุทธิ์ของ EGC Metabolites การก่อตัวของ metabolite จากEGC โดยพืชลำไส้หนูทำตามขั้นตอนเป็นอธิบายไว้ข้างต้น หลังจากฟักตัวใน 24, 48 และ 96 h, 50 mL แต่ละตัวอย่างของผสมบ่มได้นำออกใน glovebox ไม่ใช้ออกซิเจน แต่ละตัวอย่างที่ centrifuged ที่ 15000g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 C เอาแบคทีเรียเซลล์ Supernatant ได้ถูกปรับปรุง pH ประมาณ 3.5 เมตร 5HCl และสกัดสามครั้งแล้ว ด้วยเอทิล acetate ปริมาณเท่ากัน ที่เศษเอทิล acetate หายไปกับความแห้งกร้านภายใต้ความดันที่ลดลงสารตกค้างที่ได้จากการผสมบ่ม 24 h ใช้สำหรับการแยก 3 8 และสารตกค้างจากผสม 48 h 4 ในทำนองเดียวกันแยก 5-7 ที่ดำเนินการกับส่วนผสมบ่ม 96 hมีสารตกค้างแต่ละที่ได้จากส่วนผสมบ่ม 24 - และ 48-hละลายใน 3 มล.ของ 5% อควีเมทานอล และการแก้ปัญหาถูกต้องการ HPLC preparative สำหรับฟอก 3, 4 และ 8 Preparative HPLC ได้ดำเนินการโดย มีประชาชนเป็น 150 มม. 20 มม. 5 μm, Capcellpak C18 MGคอลัมน์ (อาชิเซโด้ จำกัด โตเกียว ญี่ปุ่น) ในชุด JASCO HPLC 800ระบบ (JASCO โตเกียว ญี่ปุ่น) คอลัมน์ถูก eluted กับแบบเชิงเส้นการไล่ระดับของตัวทำละลาย การเริ่มต้น ด้วยเมทานอล 10% (v/v) ละลายประกอบด้วยกรดอะซิติก 0.5% (v/v) และลงท้าย ด้วย 60% (v/v) อควีประกอบด้วยกรดอะซิติก 0.5% (v/v) ที่อัตราการไหลของ 9.7 mL/min ที่เมทานอลค. 40 รูปแบบการ elution ถูกตรวจสอบ โดยการวัด absorbance ที่270 nm ทุกฝ่ายประกอบด้วย metabolite รวบรวม และหายไปเพื่อความแห้งกร้าน สารตกค้างถูกละลายใน 5 mL ของน้ำกลั่นแล้วเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้าน ขั้นตอนนี้มีซ้ำ 2 ครั้งเพื่อเอากรดน้ำส้มทั้งหมด ตกผลแก่ได้ละละลายในน้ำกลั่นจำนวนเล็กน้อย และอบแห้งรับmetabolite 3 (17 มิลลิกรัม), metabolite 4 (15 mg), และ metabolite (5 มิลลิกรัม) 8 สำหรับแยกที่ไป 5 7 เศษเอทิล acetate ได้จาก 96 hคณะทันตแพทยศาสตร์ส่วนผสมถูกสกัด ด้วยปริมาณหนึ่งห้า 20 มม.ละลาย Na2CO3 ในกระบวนการนี้ 6 ยังคงอยู่ในชั้นอินทรีย์และ 5 และ 7 ได้กระจายในชั้นอควี Metabolite 6 ในเอทิลเศษส่วน acetate ที่บริสุทธิ์ในลักษณะเดียวกันเป็น metabolite 3 การรับ 6 บริสุทธิ์ 5 มก. ถูกละลายที่ประกอบด้วย 5 และ 7ไปประมาณ 5 mL ที่หายไป และเข้มข้นได้ปรับปรุงสถานค่า pH5.0 กับกรดน้ำส้ม 5 เมตร หลังจากเอา precipitate คงน้อยacetate) โดย centrifugation, supernatant ถูกยัดเยียดให้ preparativeHPLC HPLC ที่ดำเนินภายใต้เงื่อนไขเดียวกันดังที่ข้างต้นยกเว้นการใช้เฟสเคลื่อนที่ไม่ มีกรดอะซิติก Metabolite 7เศษส่วนที่หายไปภายใต้ความดันที่ลดลง และอบแห้งแล้ว ไปรับ metabolite บริสุทธิ์ 7 (3 มิลลิกรัม) บนมืออื่น ๆ มีเศษ 5เข้มข้นเอาการอินทรีย์และสมาธิได้ใช้การแลกเปลี่ยนไอออนคอลัมน์ 10 65 มม. 5.1 mL ของ Diaionแบบฟอร์ม SK1B Naþ (มิตซูบิชิเคมี บริษัท โตเกียว ญี่ปุ่น) ซึ่งมีแล้ว equilibrated ด้วยน้ำกลั่น คอลัมน์ถูก eluted กับ vol 5 ของน้ำกลั่น Eluate ได้เข้มข้นเพื่อประมาณ 3 mL แล้วlyophilized รับ 21 มิลลิกรัมของ metabolite 5 เป็นเกลือโซเดียมเมื่อใช้พืชอื่นลำไส้ metabolites 9-12 ได้เกิดขึ้นจาก EGC 3, 5 และ 6 (รูป 2A) แล้ว บ่ม 24 hส่วนผสมแยก 9 และ 10 ถูกปรับ pH 1.5 เมตร 5กรดฟอสฟอริกและ metabolites ถูกสกัดสามครั้ง ด้วยกันปริมาณของส่วนผสมของเอทิล acetate/เอ็น บิวทานอ (1/1, v/v) ชั้นอินทรีย์แล้วได้รับสองครั้งปริมาตรครึ่งหนึ่งของ Na2CO3 อควีมม. 100ประกอบด้วย 0.1% โซเดียม ascorbate ในขั้นตอนนี้ 9 ผ่านเข้าสู่การอควีชั้น ในขณะที่ 10 ยังคงอยู่ในชั้นอินทรีย์ ชั้นอควีปรับให้รอบค่า pH 7.0 กับ 5 M HCl และก็เข้มข้นไปประมาณ 15 mL การเข้มข้น เพิ่ม 75 mL ของเอทานอลและจากนั้นถูก centrifuged เอาวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ Supernatant ถูกเข้มข้นใน 1 mL และเข้มข้นถูกปรับให้ค่า pH 2-3กับ 2 M HCl และการ preparative HPLC เงื่อนไข HPLCไม่เหมือนกับ metabolite 5 ดังกล่าวข้างต้น Metabolite 9เศษถูกรวบรวม และเข้มข้นเอาตัวทำละลายอินทรีย์ ที่ผลแก่โซลูชันถูกรักษา ด้วยคอลัมน์แบบฟอร์ม Diaion SK1B Naþลักษณะเดียวกับ 5 เข้มข้น และ lyophilized ไป eluateขอรับ 9 บริสุทธิ์ 5 มก. ชั้น acetate เอทิลเอ็นบิวทานอประกอบด้วย 10เข้มข้นเพื่อความแห้งกร้าน สารตกค้างผลแก่ไม่รับเดียวลักษณะเป็น 3 รับ 10 บริสุทธิ์ 3 มก. Metabolites ที่ 11 และ 12 ได้บริสุทธิ์จากน้ำยาผสมบ่ม 72 h และ 168 h ตามลำดับ การใช้ขั้นตอนที่เหมือนกันสำหรับ 3 ในที่สุด 10 มก.มก. 11 และ 19 12 ได้ได้รับการ นอกจากนี้ยังถูกเปลี่ยนจาก EGC metabolite 13 โดยหนูอื่น ๆลำไส้พืช (รูปที่ 2B) บริเวณนี้ยังไม่บริสุทธิ์จาก 24 hผสมบ่มโดยใช้กระบวนการเดียวกันกับ 11 รับ 8 มก.13 บริสุทธิ์ใน
การแปล กรุณารอสักครู่..
การคัดเลือกแบคทีเรียลำไส้ความสามารถในการย่อย EGCg.
หลังจากการฆ่าเชื้อของ 9 มิลลิลิตร 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.1) โดยการ
นึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที, การแก้ปัญหา EGCg (1 มิลลิลิตร 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร)
กรองผ่านเยื่อกรองฆ่าเชื้อ DISMIC -25cs 0.2 ไมครอน (Toyo
Roshi Kaisha Ltd. , โตเกียว, ญี่ปุ่น) ถูกบันทึกอยู่ในบัฟเฟอร์ แต่ละแบคทีเรีย
สายพันธุ์ (22 จำพวก 169 สายพันธุ์) ได้รับเชื้อเพื่อแก้ปัญหาแล้ว 2 มิลลิลิตร
ของน้ำมันแร่หมันถูกชั้นกว่า ส่วนผสมที่ได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจากนั้นได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 3500g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง.
ใสได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี HPLC เพื่อเลือก enterobacteria ที่มี
ความสามารถในการย่อยสลาย EGCg HPLC เพื่อการวิเคราะห์ได้ดำเนินการกับ
250 4.6 มม id, 5 ไมโครเมตร Capcell ปาก C18 UG120 (ชิเซโด้ จำกัด ,
กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ในน่านน้ำ 2695 แยก Module (Nihon น้ำ,
โตเกียว, ญี่ปุ่น) เครื่องพร้อมกับน้ำ 2489 UV / VS ตรวจจับ
(270 นาโนเมตร) elution ที่ทำด้วยน้ำกลั่น / เมทานอล / acetonitrile /
กรดฟอสฟอรัส (85/10 / 5 / 0.01, v / v / v / v) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีที่ 40 องศาเซลเซียส.
เวลาหลักสูตรการวิเคราะห์ของ สร้าง metabolite จาก EGC
(1) โดยหนูลำไส้ Flora วิธีการบ่มเพาะของ EGC กับหนู
enterobacteria ได้ทำตามที่ Meselhy และคณะ (22) สด
เนื้อหา cecal (3.3 กรัม) ที่ได้รับจากสามหนูวิสตาร์ชาย (16 สัปดาห์ของ
อายุ) ถูกใส่ลงไปใน 300 มิลลิลิตรของน้ำซุป GAM แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ภายใต้สภาวะไร้อากาศด้วยระบบ Anaeropack (มิตซูบิชิแก๊ส
เคมิคอล, โตเกียว, ญี่ปุ่น) . หลังจาก 3 วัน, วัฒนธรรมที่ถูกปั่นโดย
Avanti J-25 (Beckman Coulter, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ 15000g 20 นาทีที่
4 องศาเซลเซียสและเซลล์เก็บเกี่ยวถูกล้างครั้งเดียวกับน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (200 มิลลิลิตร).
เซลล์ถูกระงับ ใน 150 มลของ prefiltered 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์
(pH 7.1) และ 200 มิลลิกรัมของ EGC ในปริมาณ 20 มล 5% เมทานอลน้ำ
prefiltrated กับตัวกรองเมมเบรนฆ่าเชื้อถูกบันทึกอยู่ในเซลล์
ระงับ ส่วนผสมที่ถูกบ่มภายใต้สภาวะไร้อากาศด้วย
ระบบ Anaeropack หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24, 48, 72, 96, และ 168 ชั่วโมง,
aliquots (1 มิลลิลิตร) ผสมบ่มถูกถอนออกในแบบไม่ใช้ออกซิเจน
กล่องเก็บของใต้บรรยากาศ CO2 ตัวอย่างเหล่านี้ถูกปั่นโดย MX-
301 centrifuge (TOMY Seiko, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ 15000g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส.
supernatants ผลถูกกรองด้วยตัวกรองเมมเบรนจากนั้น
วิเคราะห์โดยวิธี HPLC กล้องและระบบการ LCQ Deca XPplus (เทอร์โม
ฟิชเชอร์ วิทยาศาสตร์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) การทดลองดังกล่าวข้างต้นซ้ำมากกว่า 15
ครั้งมีเนื้อหาที่แตกต่างกัน cecal ของหนูที่แตกต่างกัน (15-21 สัปดาห์).
บริสุทธิ์ของสาร EGC การก่อ metabolite จาก
EGC โดยลำไส้เล็กของหนูที่ได้ดำเนินการตามขั้นตอนตามที่
อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24, 48, และ 96 ชั่วโมง, 50 มลตัวอย่างแต่ละ
ส่วนผสมบ่มถูกนำออกมาในกล่องเก็บของแบบไม่ใช้ออกซิเจน แต่ละ
ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15000g เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเพื่อลบแบคทีเรีย
เซลล์ สารละลายที่เกิดมีการปรับค่าพีเอชประมาณ 3.5 กับ 5 M
HCl แล้วสกัดสามครั้งมีปริมาณที่เท่ากันของเอทิลอะซีเต
ส่วนเอทิลอะซิเตถูกระเหยจนแห้งภายใต้ความกดดันที่ลดลง.
สารตกค้างที่ได้รับจากส่วนผสมบ่ม 24 ชั่วโมงที่ใช้สำหรับ
การแยก 3 และ 8 และสารตกค้างจากส่วนผสม 48 ชั่วโมงสำหรับ 4. ในทำนองเดียวกัน,
การแยกจาก 5 7 ได้ดำเนินการกับส่วนผสมบ่ม 96 ชั่วโมง.
ที่เหลือในแต่ละที่ได้รับจาก 24 และ 48 ชั่วโมงผสมบ่มถูก
กลืนหายไปใน 3 มิลลิลิตร 5% เมทานอลในน้ำและวิธีการแก้ปัญหาที่ถูกยัดเยียด
to HPLC เตรียมสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ 3, 4, และ 8. เตรียม HPLC ได้รับการ
ดำเนินการกับ 150 มิลลิเมตร 20 มิลลิเมตร id, 5 ไมโครเมตร Capcellpak C18 MG
คอลัมน์ (ชิเซโด้ จำกัด , กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ใน JASCO HPLC 800 ชุด
ระบบ (JASCO, โตเกียว, ญี่ปุ่น) คอลัมน์ถูกชะด้วยเชิงเส้น
ลาดของตัวทำละลายเริ่มต้นด้วย 10% (v / v) สารละลายเมทานอล
ที่มี 0.5% (v / v) กรดอะซิติกและลงท้ายด้วย 60% (v / v) น้ำ
เมทานอลที่มี 0.5% (V / v) และกรดอะซิติกที่อัตราการไหล 9.7 มิลลิลิตร / นาทีที่
40 องศาเซลเซียส รูปแบบชะได้รับการตรวจสอบโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่
270 นาโนเมตร ส่วนที่มี metabolite แต่ละคนได้เก็บรวบรวมและระเหย
จนแห้ง ที่เหลือก็เลือนหายไปใน 5 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นและจากนั้น
ความเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้าน ขั้นตอนนี้ซ้ำอีกสองครั้งเพื่อ
เอากรดอะซิติกอย่างสมบูรณ์ ผลตกค้างถูกบุคคล
ที่ละลายในปริมาณเล็กน้อยของน้ำกลั่นและแห้งจะได้รับ
metabolite 3 (17 มิลลิกรัม) metabolite 4 (15 มิลลิกรัม) และเมตาบอไล 8 (5 มก.) สำหรับ
การแยก 5 ถึง 7 ส่วนเอทิลอะซิเตที่ได้รับจาก 96 ชั่วโมง
บ่มส่วนผสมเป็นสารสกัดที่มีปริมาณหนึ่งในห้าของ 20 มม
สารละลาย Na2CO3 ในขั้นตอนนี้ยังคงอยู่ใน 6 ชั้นอินทรีย์
และ 5 และ 7 มีการกระจายในชั้นน้ำ metabolite 6 ในเอทิล
อะซิเตทส่วนบริสุทธิ์ในลักษณะเดียวกับที่เป็น metabolite ที่ 3 เพื่อ
ให้ได้ 5 มิลลิกรัมบริสุทธิ์ 6. สารละลายที่มี 5 และ 7 ได้รับการ
ระเหยประมาณ 5 มิลลิลิตรและเข้มข้นมีการปรับประมาณค่า pH
5.0 ที่มี 5 M กรดอะซิติก หลังจากการกำจัดตะกอน (อาจโซเดียม
อะซิเตท) โดยการหมุนเหวี่ยงใสถูกยัดเยียดให้เตรียม
HPLC HPLC ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันตามที่อธิบายไว้
ข้างต้นยกเว้นสำหรับการใช้ขั้นตอนที่มือถือโดยไม่ต้องกรดอะซิติก metabolite 7
ส่วนถูกระเหยภายใต้ความกดดันที่ลดลงและจากนั้นแห้งจะ
ได้รับ metabolite บริสุทธิ์ 7 (3 มก.) ในทางตรงกันข้าม, 5 ส่วนเป็น
ความเข้มข้นที่จะเอาตัวทำละลายอินทรีย์และสมาธิที่เกิด
ถูกนำไปใช้กับคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน 10 65 มิลลิเมตร 5.1 มิลลิลิตร Diaion
SK1B รูปแบบภูมิพลอดุลยเดช (มิตซูบิชิเคมี Co. , โตเกียว, ญี่ปุ่น) ซึ่งได้
รับการ equilibrated ด้วยน้ำกลั่น คอลัมน์ถูกชะ 5 ฉบับของ
น้ำกลั่น eluate เข้มข้นประมาณ 3 มิลลิลิตรแล้ว
แห้งจะได้รับ 21 มิลลิกรัมของ metabolite 5 เป็นเกลือโซเดียม.
เมื่อลำไส้ที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้สาร 9-12 กำลังก่อตัวขึ้น
จาก EGC นอกเหนือไปจาก 3, 5, และ 6 (รูปที่ 2A) . จากนั้นบ่ม 24 ชั่วโมง
ส่วนผสมสำหรับการแยก 9 และ 10 มีการปรับค่า pH 1.5 ที่มี 5 M
กรดฟอสฟอรัสและสารสกัดสามครั้งแบบเดียวกับ
ปริมาณของส่วนผสมของน้ำนม / n-butanol (1/1, v / v) ชั้นอินทรีย์
ได้รับการรักษาแล้วสองครั้งด้วยปริมาณ 100 มิลลิเมตรน้ำ Na2CO3 ครึ่ง
ที่มีโซเดียม ascorbate 0.1% ในขั้นตอนนี้ 9 ผ่านเข้าสู่
ชั้นน้ำในขณะที่ 10 ยังคงอยู่ในชั้นอินทรีย์ ชั้นน้ำ
มีการปรับประมาณค่า pH 7.0 ที่มี 5 M HCl และความเข้มข้นที่จะ
ประมาณ 15 มิลลิลิตร เพื่อเข้มข้น 75 มลเอทานอลถูกเพิ่มเข้ามาและจากนั้นจะ
ได้รับการหมุนเหวี่ยงเพื่อเอาวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ ใสถูก
เข้มข้นถึง 1 มิลลิลิตรแล้วสมาธิมีการปรับค่า pH 2-3
มี 2 M HCl และยัดเยียดให้เตรียม HPLC เงื่อนไข HPLC
เป็นเช่นเดียวกับเมตาบอไล 5 ดังกล่าวข้างต้น metabolite 9
ส่วนถูกเก็บรวบรวมและเข้มข้นเพื่อเอาตัวทำละลายอินทรีย์
วิธีการแก้ปัญหาผลได้รับการรักษาด้วย Diaion SK1B ภูมิพลอดุลยเดชคอลัมน์รูปแบบใน
ลักษณะเดียวกันกับการ 5. eluate สมาธิและแห้งจะ
ได้รับ 5 มิลลิกรัมบริสุทธิ์ 9. เอทิลอะซิเตท-n-butanol ชั้น 10 ที่มี
สมาธิเพื่อความแห้งกร้าน สารตกค้างผลได้รับการรักษาในเดียวกัน
อย่างเช่น 3 ที่จะได้รับ 3 มิลลิกรัมของสารบริสุทธิ์ 10. 11 และ 12 ถูก
ทำให้บริสุทธิ์จาก 72 ชั่วโมงและ 168 ชั่วโมงผสมบ่มตามลำดับโดยใช้
ขั้นตอนเดียวกันกับ 3 สุดท้าย 10 11 มิลลิกรัมและ 19 มิลลิกรัม 12 ถูก
ได้ metabolite 13 ก็เปลี่ยนจาก EGC อื่น ๆ โดยหนู
ลำไส้ (รูปที่ 2B) สารนี้ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก 24 ชั่วโมง
ส่วนผสมบ่มโดยใช้ขั้นตอนเดียวกันกับการที่จะได้รับ 11 8 มิลลิกรัม
บริสุทธิ์ 13.
ใน
หลังจากการฆ่าเชื้อของ 9 มิลลิลิตร 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.1) โดยการ
นึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที, การแก้ปัญหา EGCg (1 มิลลิลิตร 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร)
กรองผ่านเยื่อกรองฆ่าเชื้อ DISMIC -25cs 0.2 ไมครอน (Toyo
Roshi Kaisha Ltd. , โตเกียว, ญี่ปุ่น) ถูกบันทึกอยู่ในบัฟเฟอร์ แต่ละแบคทีเรีย
สายพันธุ์ (22 จำพวก 169 สายพันธุ์) ได้รับเชื้อเพื่อแก้ปัญหาแล้ว 2 มิลลิลิตร
ของน้ำมันแร่หมันถูกชั้นกว่า ส่วนผสมที่ได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจากนั้นได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 3500g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง.
ใสได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี HPLC เพื่อเลือก enterobacteria ที่มี
ความสามารถในการย่อยสลาย EGCg HPLC เพื่อการวิเคราะห์ได้ดำเนินการกับ
250 4.6 มม id, 5 ไมโครเมตร Capcell ปาก C18 UG120 (ชิเซโด้ จำกัด ,
กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ในน่านน้ำ 2695 แยก Module (Nihon น้ำ,
โตเกียว, ญี่ปุ่น) เครื่องพร้อมกับน้ำ 2489 UV / VS ตรวจจับ
(270 นาโนเมตร) elution ที่ทำด้วยน้ำกลั่น / เมทานอล / acetonitrile /
กรดฟอสฟอรัส (85/10 / 5 / 0.01, v / v / v / v) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีที่ 40 องศาเซลเซียส.
เวลาหลักสูตรการวิเคราะห์ของ สร้าง metabolite จาก EGC
(1) โดยหนูลำไส้ Flora วิธีการบ่มเพาะของ EGC กับหนู
enterobacteria ได้ทำตามที่ Meselhy และคณะ (22) สด
เนื้อหา cecal (3.3 กรัม) ที่ได้รับจากสามหนูวิสตาร์ชาย (16 สัปดาห์ของ
อายุ) ถูกใส่ลงไปใน 300 มิลลิลิตรของน้ำซุป GAM แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ภายใต้สภาวะไร้อากาศด้วยระบบ Anaeropack (มิตซูบิชิแก๊ส
เคมิคอล, โตเกียว, ญี่ปุ่น) . หลังจาก 3 วัน, วัฒนธรรมที่ถูกปั่นโดย
Avanti J-25 (Beckman Coulter, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ 15000g 20 นาทีที่
4 องศาเซลเซียสและเซลล์เก็บเกี่ยวถูกล้างครั้งเดียวกับน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (200 มิลลิลิตร).
เซลล์ถูกระงับ ใน 150 มลของ prefiltered 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์
(pH 7.1) และ 200 มิลลิกรัมของ EGC ในปริมาณ 20 มล 5% เมทานอลน้ำ
prefiltrated กับตัวกรองเมมเบรนฆ่าเชื้อถูกบันทึกอยู่ในเซลล์
ระงับ ส่วนผสมที่ถูกบ่มภายใต้สภาวะไร้อากาศด้วย
ระบบ Anaeropack หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24, 48, 72, 96, และ 168 ชั่วโมง,
aliquots (1 มิลลิลิตร) ผสมบ่มถูกถอนออกในแบบไม่ใช้ออกซิเจน
กล่องเก็บของใต้บรรยากาศ CO2 ตัวอย่างเหล่านี้ถูกปั่นโดย MX-
301 centrifuge (TOMY Seiko, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ 15000g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส.
supernatants ผลถูกกรองด้วยตัวกรองเมมเบรนจากนั้น
วิเคราะห์โดยวิธี HPLC กล้องและระบบการ LCQ Deca XPplus (เทอร์โม
ฟิชเชอร์ วิทยาศาสตร์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) การทดลองดังกล่าวข้างต้นซ้ำมากกว่า 15
ครั้งมีเนื้อหาที่แตกต่างกัน cecal ของหนูที่แตกต่างกัน (15-21 สัปดาห์).
บริสุทธิ์ของสาร EGC การก่อ metabolite จาก
EGC โดยลำไส้เล็กของหนูที่ได้ดำเนินการตามขั้นตอนตามที่
อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24, 48, และ 96 ชั่วโมง, 50 มลตัวอย่างแต่ละ
ส่วนผสมบ่มถูกนำออกมาในกล่องเก็บของแบบไม่ใช้ออกซิเจน แต่ละ
ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15000g เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเพื่อลบแบคทีเรีย
เซลล์ สารละลายที่เกิดมีการปรับค่าพีเอชประมาณ 3.5 กับ 5 M
HCl แล้วสกัดสามครั้งมีปริมาณที่เท่ากันของเอทิลอะซีเต
ส่วนเอทิลอะซิเตถูกระเหยจนแห้งภายใต้ความกดดันที่ลดลง.
สารตกค้างที่ได้รับจากส่วนผสมบ่ม 24 ชั่วโมงที่ใช้สำหรับ
การแยก 3 และ 8 และสารตกค้างจากส่วนผสม 48 ชั่วโมงสำหรับ 4. ในทำนองเดียวกัน,
การแยกจาก 5 7 ได้ดำเนินการกับส่วนผสมบ่ม 96 ชั่วโมง.
ที่เหลือในแต่ละที่ได้รับจาก 24 และ 48 ชั่วโมงผสมบ่มถูก
กลืนหายไปใน 3 มิลลิลิตร 5% เมทานอลในน้ำและวิธีการแก้ปัญหาที่ถูกยัดเยียด
to HPLC เตรียมสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ 3, 4, และ 8. เตรียม HPLC ได้รับการ
ดำเนินการกับ 150 มิลลิเมตร 20 มิลลิเมตร id, 5 ไมโครเมตร Capcellpak C18 MG
คอลัมน์ (ชิเซโด้ จำกัด , กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ใน JASCO HPLC 800 ชุด
ระบบ (JASCO, โตเกียว, ญี่ปุ่น) คอลัมน์ถูกชะด้วยเชิงเส้น
ลาดของตัวทำละลายเริ่มต้นด้วย 10% (v / v) สารละลายเมทานอล
ที่มี 0.5% (v / v) กรดอะซิติกและลงท้ายด้วย 60% (v / v) น้ำ
เมทานอลที่มี 0.5% (V / v) และกรดอะซิติกที่อัตราการไหล 9.7 มิลลิลิตร / นาทีที่
40 องศาเซลเซียส รูปแบบชะได้รับการตรวจสอบโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่
270 นาโนเมตร ส่วนที่มี metabolite แต่ละคนได้เก็บรวบรวมและระเหย
จนแห้ง ที่เหลือก็เลือนหายไปใน 5 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นและจากนั้น
ความเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้าน ขั้นตอนนี้ซ้ำอีกสองครั้งเพื่อ
เอากรดอะซิติกอย่างสมบูรณ์ ผลตกค้างถูกบุคคล
ที่ละลายในปริมาณเล็กน้อยของน้ำกลั่นและแห้งจะได้รับ
metabolite 3 (17 มิลลิกรัม) metabolite 4 (15 มิลลิกรัม) และเมตาบอไล 8 (5 มก.) สำหรับ
การแยก 5 ถึง 7 ส่วนเอทิลอะซิเตที่ได้รับจาก 96 ชั่วโมง
บ่มส่วนผสมเป็นสารสกัดที่มีปริมาณหนึ่งในห้าของ 20 มม
สารละลาย Na2CO3 ในขั้นตอนนี้ยังคงอยู่ใน 6 ชั้นอินทรีย์
และ 5 และ 7 มีการกระจายในชั้นน้ำ metabolite 6 ในเอทิล
อะซิเตทส่วนบริสุทธิ์ในลักษณะเดียวกับที่เป็น metabolite ที่ 3 เพื่อ
ให้ได้ 5 มิลลิกรัมบริสุทธิ์ 6. สารละลายที่มี 5 และ 7 ได้รับการ
ระเหยประมาณ 5 มิลลิลิตรและเข้มข้นมีการปรับประมาณค่า pH
5.0 ที่มี 5 M กรดอะซิติก หลังจากการกำจัดตะกอน (อาจโซเดียม
อะซิเตท) โดยการหมุนเหวี่ยงใสถูกยัดเยียดให้เตรียม
HPLC HPLC ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันตามที่อธิบายไว้
ข้างต้นยกเว้นสำหรับการใช้ขั้นตอนที่มือถือโดยไม่ต้องกรดอะซิติก metabolite 7
ส่วนถูกระเหยภายใต้ความกดดันที่ลดลงและจากนั้นแห้งจะ
ได้รับ metabolite บริสุทธิ์ 7 (3 มก.) ในทางตรงกันข้าม, 5 ส่วนเป็น
ความเข้มข้นที่จะเอาตัวทำละลายอินทรีย์และสมาธิที่เกิด
ถูกนำไปใช้กับคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน 10 65 มิลลิเมตร 5.1 มิลลิลิตร Diaion
SK1B รูปแบบภูมิพลอดุลยเดช (มิตซูบิชิเคมี Co. , โตเกียว, ญี่ปุ่น) ซึ่งได้
รับการ equilibrated ด้วยน้ำกลั่น คอลัมน์ถูกชะ 5 ฉบับของ
น้ำกลั่น eluate เข้มข้นประมาณ 3 มิลลิลิตรแล้ว
แห้งจะได้รับ 21 มิลลิกรัมของ metabolite 5 เป็นเกลือโซเดียม.
เมื่อลำไส้ที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้สาร 9-12 กำลังก่อตัวขึ้น
จาก EGC นอกเหนือไปจาก 3, 5, และ 6 (รูปที่ 2A) . จากนั้นบ่ม 24 ชั่วโมง
ส่วนผสมสำหรับการแยก 9 และ 10 มีการปรับค่า pH 1.5 ที่มี 5 M
กรดฟอสฟอรัสและสารสกัดสามครั้งแบบเดียวกับ
ปริมาณของส่วนผสมของน้ำนม / n-butanol (1/1, v / v) ชั้นอินทรีย์
ได้รับการรักษาแล้วสองครั้งด้วยปริมาณ 100 มิลลิเมตรน้ำ Na2CO3 ครึ่ง
ที่มีโซเดียม ascorbate 0.1% ในขั้นตอนนี้ 9 ผ่านเข้าสู่
ชั้นน้ำในขณะที่ 10 ยังคงอยู่ในชั้นอินทรีย์ ชั้นน้ำ
มีการปรับประมาณค่า pH 7.0 ที่มี 5 M HCl และความเข้มข้นที่จะ
ประมาณ 15 มิลลิลิตร เพื่อเข้มข้น 75 มลเอทานอลถูกเพิ่มเข้ามาและจากนั้นจะ
ได้รับการหมุนเหวี่ยงเพื่อเอาวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ ใสถูก
เข้มข้นถึง 1 มิลลิลิตรแล้วสมาธิมีการปรับค่า pH 2-3
มี 2 M HCl และยัดเยียดให้เตรียม HPLC เงื่อนไข HPLC
เป็นเช่นเดียวกับเมตาบอไล 5 ดังกล่าวข้างต้น metabolite 9
ส่วนถูกเก็บรวบรวมและเข้มข้นเพื่อเอาตัวทำละลายอินทรีย์
วิธีการแก้ปัญหาผลได้รับการรักษาด้วย Diaion SK1B ภูมิพลอดุลยเดชคอลัมน์รูปแบบใน
ลักษณะเดียวกันกับการ 5. eluate สมาธิและแห้งจะ
ได้รับ 5 มิลลิกรัมบริสุทธิ์ 9. เอทิลอะซิเตท-n-butanol ชั้น 10 ที่มี
สมาธิเพื่อความแห้งกร้าน สารตกค้างผลได้รับการรักษาในเดียวกัน
อย่างเช่น 3 ที่จะได้รับ 3 มิลลิกรัมของสารบริสุทธิ์ 10. 11 และ 12 ถูก
ทำให้บริสุทธิ์จาก 72 ชั่วโมงและ 168 ชั่วโมงผสมบ่มตามลำดับโดยใช้
ขั้นตอนเดียวกันกับ 3 สุดท้าย 10 11 มิลลิกรัมและ 19 มิลลิกรัม 12 ถูก
ได้ metabolite 13 ก็เปลี่ยนจาก EGC อื่น ๆ โดยหนู
ลำไส้ (รูปที่ 2B) สารนี้ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก 24 ชั่วโมง
ส่วนผสมบ่มโดยใช้ขั้นตอนเดียวกันกับการที่จะได้รับ 11 8 มิลลิกรัม
บริสุทธิ์ 13.
ใน
การแปล กรุณารอสักครู่..
การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการย่อยที่มี EGCG .
หลังจากทำหมัน 9 ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.1 ) โดย
อัตราส่วนโฟกัสที่ 121 C เป็นเวลา 15 นาที อีจีซีจี โซลูชั่น ( 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ต่อ 1 มิลลิลิตร ) กรองผ่านไส้กรองเมมเบรน
ฆ่าเชื้อ dismic-25cs 0.2 M (
μโตโยโรชิ kaisha จำกัด โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ถูกเพิ่มลงในบัฟเฟอร์ แต่ละสายพันธุ์แบคทีเรีย
( 22 สกุล169 สายพันธุ์ ) เป็นเชื้อเพื่อการแก้ไขแล้ว 2 มล. ของน้ำมันเป็นหมันคือ
ชั้นมากกว่า ส่วนผสมจะถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
และเป็นระดับที่ 3500g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง ได้ถูกวิเคราะห์โดย HPLC นำ
เลือกเทอโรแบคทีเรียที่มีความสามารถย่อยสลาย EGCG . วิเคราะห์และดำเนินการกับ
250 4.6 มม. บัตร 5 μ Mcapcell ปาก c18 ug120 ( Shiseido Co . Ltd . ,
โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ในน้ำ 2695 แยกโมดูล ( Nihon น้ำ
โตเกียว , ญี่ปุ่น ) เครื่องมืออุปกรณ์ที่มีน้ำ 2489 UV / VS เครื่องตรวจจับ
( 270 nm ) ได้มาแล้วกับน้ำกลั่น / เมทานอล / ไน /
กรดฟอสฟอริก ( 85 / 10 / 5 / 01 / v / v / V ) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีที่ 40 C .
เวลาหลักสูตรการวิเคราะห์การ egc
จากอุณหภูมิ( 1 ) โดยหนู intestinal ฟลอร่า วิธีการบ่ม egc กับหนู
เทอโรแบคทีเรียมันเป็นไปตามที่ meselhy et al . ( 22 ) เนื้อหาสดลำไส้ใหญ่ซีคัม
( 3.3 กรัม ) ที่ได้จากสามหนูพุกขาวชาย ( 16 สัปดาห์
อายุ ) ใส่ลงไปในน้ำ 300 มิลลิลิตรของ GAM และบ่มที่ 37 C
ภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนที่มี anaeropack ระบบ ( มิตซูบิชิ แก๊ส
เคมี , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) หลังจาก 3 วันวัฒนธรรมคือระดับโดย
AVANTI j-25 ( Beckman Coulter , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ที่ 15000g สำหรับ 20 นาทีที่
4 C และเก็บเกี่ยวเซลล์ถูกล้างกับน้ำหมัน ( 200 ml ) .
เซลล์ถูกระงับใน 150 มิลลิลิตร prefiltered 0.1 M phosphate buffer
( pH 7.1 ) และ 200 มิลลิกรัม egc 20 ml 5% สารละลายเมทานอล
prefiltrated ด้วยเยื่อกรองฆ่าเชื้อเพิ่มไปยังเซลล์
ระงับส่วนผสมจะถูกบ่มภายใต้สภาวะไร้อากาศระบบ anaeropack
. หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 , 48 , 72 และ 96 , 168 H ,
เฉยๆ ( 1 มล. ) ของการบ่มในถังผสมที่ถูกถอน
glovebox ภายใต้บรรยากาศของ CO2 ตัวอย่างเหล่านี้เป็นระดับโดย MX -
0 ( ญี่ปุ่น Tomy Seiko , โตเกียว , ) ที่ 15000g สำหรับ 10 นาทีที่
4 Cผล supernatants ถูกกรองด้วยไส้กรองเมมเบรน แล้ววิเคราะห์ด้วย HPLC และ
เนจ lcq เดคา xpplus ระบบเทอร์โม
ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , USA ) การทดลองข้างต้นกันมากกว่า 15 ครั้ง มีเนื้อหาแตกต่างกัน
ลำไส้ใหญ่ซีคัมของหนูที่แตกต่างกัน ( 15-21 สัปดาห์ )
egc สารฟอก . เพียงการก่อตัวจาก
egc โดยหนูลำไส้ฟลอร่า มีการปฏิบัติตามกระบวนการ
ที่อธิบายข้างต้น หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 , 48 และ 96 ชั่วโมง , 50 ml แต่ละตัวอย่าง
ของส่วนผสมถูกบ่มใน glovebox แบบไม่ใช้ออกซิเจน แต่ละระดับที่ 15000g
ตัวอย่างสำหรับ 20 นาทีที่ 4 C เพื่อลบแบคทีเรีย
เซลล์ นำผลคือปรับ pH 3.5 M
5กรดไฮโดรคลอริก แล้วสกัด 3 ครั้ง มีปริมาณเท่ากันของเอทิลอะซิเทต
ethyl acetate เศษส่วนคือระเหยแห้งภายใต้การลดความดัน
กากที่ได้จาก 24-h บ่มส่วนผสมใช้
แยก 3 และ 8 และสารตกค้างจากส่วนผสม 30 4 . โดย
แยก 5 ถึง 7 แสดงกับ 96-h
บ่มส่วนผสม
หลังจากทำหมัน 9 ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.1 ) โดย
อัตราส่วนโฟกัสที่ 121 C เป็นเวลา 15 นาที อีจีซีจี โซลูชั่น ( 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ต่อ 1 มิลลิลิตร ) กรองผ่านไส้กรองเมมเบรน
ฆ่าเชื้อ dismic-25cs 0.2 M (
μโตโยโรชิ kaisha จำกัด โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ถูกเพิ่มลงในบัฟเฟอร์ แต่ละสายพันธุ์แบคทีเรีย
( 22 สกุล169 สายพันธุ์ ) เป็นเชื้อเพื่อการแก้ไขแล้ว 2 มล. ของน้ำมันเป็นหมันคือ
ชั้นมากกว่า ส่วนผสมจะถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
และเป็นระดับที่ 3500g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง ได้ถูกวิเคราะห์โดย HPLC นำ
เลือกเทอโรแบคทีเรียที่มีความสามารถย่อยสลาย EGCG . วิเคราะห์และดำเนินการกับ
250 4.6 มม. บัตร 5 μ Mcapcell ปาก c18 ug120 ( Shiseido Co . Ltd . ,
โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ในน้ำ 2695 แยกโมดูล ( Nihon น้ำ
โตเกียว , ญี่ปุ่น ) เครื่องมืออุปกรณ์ที่มีน้ำ 2489 UV / VS เครื่องตรวจจับ
( 270 nm ) ได้มาแล้วกับน้ำกลั่น / เมทานอล / ไน /
กรดฟอสฟอริก ( 85 / 10 / 5 / 01 / v / v / V ) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีที่ 40 C .
เวลาหลักสูตรการวิเคราะห์การ egc
จากอุณหภูมิ( 1 ) โดยหนู intestinal ฟลอร่า วิธีการบ่ม egc กับหนู
เทอโรแบคทีเรียมันเป็นไปตามที่ meselhy et al . ( 22 ) เนื้อหาสดลำไส้ใหญ่ซีคัม
( 3.3 กรัม ) ที่ได้จากสามหนูพุกขาวชาย ( 16 สัปดาห์
อายุ ) ใส่ลงไปในน้ำ 300 มิลลิลิตรของ GAM และบ่มที่ 37 C
ภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนที่มี anaeropack ระบบ ( มิตซูบิชิ แก๊ส
เคมี , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) หลังจาก 3 วันวัฒนธรรมคือระดับโดย
AVANTI j-25 ( Beckman Coulter , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ที่ 15000g สำหรับ 20 นาทีที่
4 C และเก็บเกี่ยวเซลล์ถูกล้างกับน้ำหมัน ( 200 ml ) .
เซลล์ถูกระงับใน 150 มิลลิลิตร prefiltered 0.1 M phosphate buffer
( pH 7.1 ) และ 200 มิลลิกรัม egc 20 ml 5% สารละลายเมทานอล
prefiltrated ด้วยเยื่อกรองฆ่าเชื้อเพิ่มไปยังเซลล์
ระงับส่วนผสมจะถูกบ่มภายใต้สภาวะไร้อากาศระบบ anaeropack
. หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 , 48 , 72 และ 96 , 168 H ,
เฉยๆ ( 1 มล. ) ของการบ่มในถังผสมที่ถูกถอน
glovebox ภายใต้บรรยากาศของ CO2 ตัวอย่างเหล่านี้เป็นระดับโดย MX -
0 ( ญี่ปุ่น Tomy Seiko , โตเกียว , ) ที่ 15000g สำหรับ 10 นาทีที่
4 Cผล supernatants ถูกกรองด้วยไส้กรองเมมเบรน แล้ววิเคราะห์ด้วย HPLC และ
เนจ lcq เดคา xpplus ระบบเทอร์โม
ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , USA ) การทดลองข้างต้นกันมากกว่า 15 ครั้ง มีเนื้อหาแตกต่างกัน
ลำไส้ใหญ่ซีคัมของหนูที่แตกต่างกัน ( 15-21 สัปดาห์ )
egc สารฟอก . เพียงการก่อตัวจาก
egc โดยหนูลำไส้ฟลอร่า มีการปฏิบัติตามกระบวนการ
ที่อธิบายข้างต้น หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 , 48 และ 96 ชั่วโมง , 50 ml แต่ละตัวอย่าง
ของส่วนผสมถูกบ่มใน glovebox แบบไม่ใช้ออกซิเจน แต่ละระดับที่ 15000g
ตัวอย่างสำหรับ 20 นาทีที่ 4 C เพื่อลบแบคทีเรีย
เซลล์ นำผลคือปรับ pH 3.5 M
5กรดไฮโดรคลอริก แล้วสกัด 3 ครั้ง มีปริมาณเท่ากันของเอทิลอะซิเทต
ethyl acetate เศษส่วนคือระเหยแห้งภายใต้การลดความดัน
กากที่ได้จาก 24-h บ่มส่วนผสมใช้
แยก 3 และ 8 และสารตกค้างจากส่วนผสม 30 4 . โดย
แยก 5 ถึง 7 แสดงกับ 96-h
บ่มส่วนผสม
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- specimen
- Thread
- everyone is protecting themselves
- ฉันอิจฉานกที่มันบินได้
- สอบวิชาแรกก็เวียนหัวแล้ว
- A bartender also should know the bar so
- Size of cells determine the accuracy of
- However,there are few studies reporting
- ตามการสำรวจในเชิงลึกโดยมหาวิทยาลัยหอการค
- ดูแลฐาน
- 이것은
- Burn
- Thatis it
- เธอเป็นคนเก่ง
- คนบางคนก็เหมาะกับการอยู่ในฝันมากกว่าชีวิ
- ลูกข่าง
- One number and one uppercase character r
- I didn't edit this picturei not have Yug
- Sunday meet me
- เสร็จ แล้วนำไปใส่ในกระทะ
- He hed been willing to cut
- Human Resources Department The Stock Exc
- เพดาน
- สอบวิชาแรกก็ปวดหัวแล้ว
