2.2. Chromosome preparation2.2.1. P

2.2. Chromosome preparation
2.2.1. Peripheral blood culture
Blood samples were collected using a sterile needle
and sterile syringe with anticoagulant (Heparin) fromthe
male rabbit central artery. Cell cultures were prepared in
PB Max Karyotyping medium (Gibco, Invitrogen).
One ml of whole blood was added to 10 ml of the
culture medium and incubated in flack-task tubes for
72 h at 37 8C in 5% CO2 and 95% humidity. For cell
cycle synchronization 200 ml of thymidine solution
(8 mg/ml in PBS) was added at 56 h of culture, and
colcemide (0.10 mg/ml) was added 4.5 h before harvest
to arrest lymphocytes at metaphase. The cultures were
then centrifuged at 300 g for 10 min, supernatant was
removed and 10 ml of 0.075 M potassium chloride
(hypotonic solution) was added to cause hypotonic
shock (during 20 min), allowing the entrance of fluids
and inducing cellular lysis. Cells were then washed and
centrifuged at 300 g for 10 min. Supernatant was
extracted and modified Carnoy’s fixative solution (3:1
methanol-acetic acid) was added during constant
agitation to avoid fiber formation; the treatment was
repeated at least three times.
2.2.2. Cell harvest
The fixed cell suspension was then dropped onto
microscope slides for examination. Microscope slides
were prepared for microscope examination with a
protocol described by Henegariu [15].
Chromosomal analysis was carried out from chromosome
photomicrographs, using 50 metaphase spreads for
numerical chromosome evaluation per rabbit. The slides
were examined by light microscopy at amagnification of
1000X. Completemetaphase spreads that did not present
any overlap and were not fractionated were photographed.
Metaphases pictures were analyzed with the aid
of Leica CW4000, software. As a result of this analysis
the males were classified as males A, those that showed
aneuploidy, and males N or normal males.
2.3. Semen analyses and insemination procedure
Semen was collected randomly from March to
August with the aid of an artificial vagina. Only
ejaculates exhibiting a white colour were used in the
experiment, and if gel was present, it was removed.
Then the volume was recorded.
Aliquots from each ejaculate (10 ml) were diluted
1:20 in an extender (Tris-citrate acid-glucose) containing
bovine serum albumin 0.3% (BSA) to prevent the
spermatozoa from sticking to the glassware during
motility analysis. Ten microliters of the diluted sample
was placed into a 10 mmdeep Makler counting chamber
(Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) for motility
analysis using a computer-assisted sperm analysis
(CASA) system (Sperm Class Analyzer, S.C.A.,
Microptic, Barcelona, Spain). Sperm motility was
assessed at 37 8C with 10X phase contrast objective.
For each sample four microscope fields were analyzed.
The percentage of total motile spermatozoa (MOT, %),
average path velocity (VAP, mm/s; the average velocity
of the smoothed cell path), curvilinear velocity (VCL,
mm/s; the average velocity measured over the actual
point to point track followed by the cell), straight-line
velocity (VSL, mm/s; the average velocity measured in
a straight line from the beginning to the end of the
track), linearity index (LIN = (VSL/VCL) x100, %),
amplitude of lateral head displacement (ALH, mm; the
mean width of the head oscillation as the sperm cells
swim), straightness coefficient (STR = (VAP/VCL)
x100, %), and wobble (WOB = (VAP/VCL) x100, %;
a measure of the oscillation of the actual trajectory
about its spatial average path) were recorded.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 เตรียมโครโมโซม
2.2.1 วัฒนธรรมเลือด
เก็บตัวอย่างเลือดโดยใช้เข็มผ่านการฆ่าเชื้อ
และเข็มฉีดยาฆ่าเชื้อที่มีสารกันเลือดแข็ง (เฮ) fromthe
กระต่ายชายหลอดเลือดกลาง เซลล์วัฒนธรรมได้จัดทำขึ้น
กลาง PB karyotyping แม็กซ์ (Gibco, Invitrogen).
หนึ่งมิลลิลิตรของเลือดถูกบันทึกอยู่ใน 10 มิลลิลิตรของ
อาหารเลี้ยงเชื้อและบ่มในหลอด Flack งานสำหรับ
72 ชั่วโมงที่ 37 8C ใน 5% CO2 และความชื้น 95% . สำหรับเซลล์
ประสานรอบ 200 มล. ของการแก้ปัญหา thymidine
(8 mg / ml ในพีบีเอส) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 56 ชั่วโมงของวัฒนธรรมและ
colcemide (0.10 mg / ml) ถูกเพิ่มเข้ามา 4.5 ชั่วโมงก่อนการเก็บเกี่ยว
ที่จะจับกุมเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ metaphase วัฒนธรรมที่ถูก
ปั่นแล้วที่ 300 กรัมเป็นเวลา 10 นาที, ใสถูก
ลบออกและ 10 มล 0.075 M โพแทสเซียมคลอไรด์
(สารละลาย hypotonic) ถูกเพิ่มเข้ามาจะทำให้เกิด hypotonic
ช็อต (ในช่วง 20 นาที) ช่วยให้การเข้ามาของของเหลว
และกระตุ้นให้เกิดการสลายเซลลูลาร์ เซลล์ที่ถูกล้างแล้วและ
หมุนเหวี่ยงที่ 300 กรัมเป็นเวลา 10 นาที ใสถูก
สกัดและแก้ไขวิธีการแก้ปัญหาตรึง Carnoy (3: 1
เมทานอลกรดอะซิติก-) เพิ่มขึ้นในช่วงคง
ปั่นป่วนเพื่อหลีกเลี่ยงการก่อเส้นใย การรักษาที่ถูก
ทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง.
2.2.2 การเก็บเกี่ยวเซลล์
เซลล์แขวนลอยคงที่จากนั้นก็ลงบน
สไลด์กล้องจุลทรรศน์สำหรับการตรวจสอบ สไลด์กล้องจุลทรรศน์
กำลังเตรียมพร้อมสำหรับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์
โปรโตคอลอธิบายโดย Henegariu [15].
การวิเคราะห์โครโมโซมได้ดำเนินการจากโครโมโซม
photomicrographs ใช้ 50 metaphase กระจายสำหรับ
การประเมินผลโครโมโซมตัวเลขต่อกระต่าย ภาพนิ่ง
ที่ได้รับการตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงที่ amagnification ของ
1000X กระจาย Completemetaphase ที่ไม่ได้นำเสนอ
การทับซ้อนใด ๆ และไม่ได้ถูกถ่ายภาพ fractionated.
ภาพ Metaphases วิเคราะห์ด้วยความช่วยเหลือ
ของ Leica CW4000, ซอฟแวร์ อันเป็นผลมาจากการวิเคราะห์นี้
ชายถูกจัดให้เป็นเพศผู้ที่แสดงให้เห็น
aneuploidy และเพศ N หรือเพศปกติ.
2.3 การวิเคราะห์น้ำอสุจิและวิธีการผสมเทียม
น้ำเชื้อเก็บสุ่มตั้งแต่เดือนมีนาคมถึง
เดือนสิงหาคมด้วยความช่วยเหลือของช่องคลอดเทียม เฉพาะ
ejaculates แสดงสีขาวที่ใช้ใน
การทดลองและถ้าเจลอยู่ในปัจจุบันก็จะถูกลบออก.
จากนั้นปริมาณการได้รับการบันทึก.
aliquots จากแต่ละอุทาน (10 มล.) ได้รับการปรับลด
01:20 ในขยาย (กรด Tris-ซิเตรต กลูโคส) ที่มี
ซีรั่มอัลบูมิวัว 0.3% (บีเอสเอ) เพื่อป้องกันไม่ให้
สเปิร์มจากการเกาะแก้วในระหว่าง
การวิเคราะห์การเคลื่อนไหว สิบ microliters ของกลุ่มตัวอย่างเจือจาง
ถูกวางลง 10 mmdeep Makler นับห้อง
(Sefi เครื่องมือแพทย์, อิสราเอล) สำหรับการเคลื่อนไหวของ
การวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ที่สเปิร์มคอมพิวเตอร์ช่วย
(CASA) ระบบ (สเปิร์มคลาสวิเคราะห์ SCA,
Microptic บาร์เซโลนาประเทศสเปน ) การเคลื่อนไหวของอสุจิได้รับการ
ประเมินที่ 37 8C กับ 10X เฟสวัตถุประสงค์ตรงกันข้าม.
สำหรับแต่ละตัวอย่างสี่สาขากล้องจุลทรรศน์วิเคราะห์.
ร้อยละของการเคลื่อนไหวรวมตัวอสุจิ (MOT,%)
เส้นทางความเร็วเฉลี่ย (VAP, mm / s; ความเร็วเฉลี่ย
ของเรียบ เส้นทางเซลล์) ความเร็วโค้ง (VCL,
mm / s; วัดความเร็วเฉลี่ยที่เกิดขึ้นจริงในช่วง
ชี้ไปที่จุดติดตามตามด้วยเซลล์) เส้นตรง
ความเร็ว (VSL, mm / s; ความเร็วเฉลี่ยในวัด
เป็นเส้นตรงจาก จุดเริ่มต้นถึงจุดสิ้นสุดของ
แทร็ค) ดัชนีเชิงเส้น (LIN = (VSL / VCL) x100,%)
ความกว้างของรางหัวด้านข้าง (ALH, มม
ความกว้างเฉลี่ยของการสั่นหัวเป็นเซลล์สเปิร์ม
ว่ายน้ำ), ตรง ค่าสัมประสิทธิ์ (STR = (VAP / VCL)
x100%) และโยกเยก (WOB = (VAP / VCL) x100%;
มาตรการของการสั่นของวิถีที่เกิดขึ้นจริง
เกี่ยวกับเส้นทางเฉลี่ยอวกาศ) ที่ถูกบันทึกไว้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การเตรียมโครโมโซม
2.2.1 . อุปกรณ์การเพาะเชื้อในเลือด
เก็บตัวอย่างเลือด การใช้เข็มฉีดยาฆ่าเชื้อและฆ่าเชื้อด้วย

เลือด ( heparin ) จากชายกระต่ายกลางหลอดเลือดแดง เซลล์วัฒนธรรมเตรียมใน
PB แม็กซ์โครโมโซมขนาดกลาง ( gibco Invitrogen , )
1 มิลลิลิตรของเลือดทั้งหมดถูกเพิ่ม 10 มล.
สื่อวัฒนธรรมและ บ่มในหลอดงานแฟล็กสำหรับ
72 ชั่วโมง ที่ 37 8C ในคาร์บอนไดออกไซด์ 5% และ 95 % ความชื้น สำหรับรอบ 200 มิลลิลิตร ให้เซลล์

โซลูชั่นไทมิดีน ( 8 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรใน PBS ) เพิ่มที่ 56 H ของวัฒนธรรมและ
colcemide ( 0.10 มก. / มล. ) เพิ่ม 4.5 ชั่วโมง ก่อนการเก็บเกี่ยว
จับเม็ดเลือดขาวที่เมทาเฟส วัฒนธรรมคือ
แล้วระดับที่ 300 กรัม เป็นเวลา 10 นาที นำออก และ 10 มิลลิลิตรได้

0.075 m โพแทสเซียมคลอไรด์( ไฮโปโทนิก โซลูชั่น ) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้ไฮโปโทนิก
ช็อก ( ในช่วง 20 นาที ) ช่วยให้ประตูทางเข้าของของเหลว
และกระตุ้นเซลล์เสื่อม . เซลล์ก็แล้ว ล้างและ
ระดับที่ 300 กรัมนาน 10 นาที นำกำลังสกัดและแก้ไข carnoy
เป็นฟิกเซทีฟโซลูชั่น ( 3
เมทานอลกรดอะซิติก ) ถูกเพิ่มเข้ามาในช่วงที่คงที่เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างเส้นใย
กวน ; การรักษา

ซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง2.2.2 . เก็บเกี่ยวเซลล์ซ่อมเซลล์แขวนลอยอยู่

แล้วหล่นลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์สำหรับตรวจสอบ กล้องจุลทรรศน์สไลด์
เตรียมสำหรับกล้องจุลทรรศน์ตรวจด้วย
( อธิบายโดย henegariu [ 15 ] .
การวิเคราะห์โครโมโซมถูกหามออกจากโครโมโซม
photomicrographs ใช้ 50 กระจายองค์ประกอบสำหรับ
เชิงตัวเลขโครโมโซมประเมินผลต่อกระต่าย ภาพนิ่ง
ถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงที่ amagnification ของ
1000x . completemetaphase กระจายที่ไม่ได้นำเสนอใด ๆทับซ้อนกันและไม่พบ

ได้ถ่ายภาพ ภาพ metaphases วิเคราะห์ด้วยความช่วยเหลือของ Leica
cw4000 ซอฟแวร์ ผลของการวิเคราะห์นี้
ผู้ชายแบ่งออกเป็นเพศชาย , ผู้ที่พบ
หญิงโสเภณี และเพศชายหรือเพศผู้ปกติ
2.3การวิเคราะห์น้ำเชื้อผสมเทียมน้ำเชื้อและขั้นตอน
เก็บแบบสุ่มจากเดือนมีนาคม
สิงหาคมด้วยความช่วยเหลือของช่องคลอดเทียม เท่านั้น
ejaculates สีขาว ซึ่งถูกใช้ในการทดลอง
และถ้าเจลเป็นปัจจุบัน มันถูกลบออก .
แล้วเสียงบันทึก
เฉยๆจากแต่ละอุทาน ( 10 ml ) ลด
1 : 20 ใน Extender ( หรือกลูโคสกรดซิเตรต
) ที่มีอัลบูมิน 0.3% ( BSA ) เพื่อป้องกันไม่ให้อสุจิที่ผสานกับเครื่องแก้ว

ในการวิเคราะห์ที่เหมาะสม 10 ตัวเลขของเจือจางตัวอย่าง
อยู่เป็น 10 mmdeep makler นับห้อง
( เครื่องมือแพทย์ Sefi ไฮฟาอิสราเอล ) การวิเคราะห์การเคลื่อนที่โดยใช้คอมพิวเตอร์ช่วยวิเคราะห์

อสุจิ ( สเปิร์ม ( CASA ) ระบบห้องวิเคราะห์ s.c.a.
microptic , บาร์เซโลนา , สเปน )เปอร์เซ็นต์อสุจิเคลื่อนไหวคือ
ประเมิน 37 8C กับ 10x สำปั้นวัตถุประสงค์ .
สำหรับแต่ละตัวอย่างสี่กล้องจุลทรรศน์ สาขาข้อมูล อสุจิเคลื่อนที่ รวมค่า

( มด , % ) ความเร็วเฉลี่ย ( เส้นทางแว็ป , mm / s ; ความเร็วเฉลี่ย
ของเส้นทางเรียบเซลล์ ) ความเร็ว ( VCL , เส้นโค้ง ,
mm / s ; ความเร็วเฉลี่ยวัดเหนือจริง
ชี้ไปที่จุดติดตามตามด้วยเซลล์ )ความเร็ว -
( vsl , mm / s ; ความเร็วเฉลี่ยวัด
เส้นตรงจากจุดเริ่มต้นไปยังจุดสิ้นสุดของ
ติดตาม ) , ดัชนีภาวะเชิงเส้น ( หลิน = ( vsl / VCL ) าย ( % ) ,
แอมพลิจูดการกระจัดหัวด้านข้าง ( ALH อืม ;
หมายถึงความกว้างของหัว นี้เป็นเซลล์อสุจิ
ว่ายน้ำ ) , ค่าสัมประสิทธิ์ความตรง ( STR = ( แว็ป / าย ( VCL )
% ) และส่ายไปส่ายมา ( wob = ( แว็ป / VCL ) าย % ;
,วัดความผันผวนของจริงวิถี
เกี่ยวกับเส้นทางเฉลี่ยของพื้นที่ ) ถูกบันทึกไว้