2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemicals

Astaxanthin (purity > 98%) was purchased from Sigma–Aldrich Co. LLC (Shanghai, China). HP-β-CD (purity > 99%, DS = 5.5) purchased from Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Chuoku, Osaka, Japan). Astaxanthin/HPCD inclusion complex was prepared in our own lab. All other reagents were of analytical grade. The water used was double distilled and deionized.

2.2. Preparation of astaxanthin/HPCD inclusion complex

10 mg astaxanthin was dissolved in 10 mL dichloromethane and added to 40 mL HPCD methanol solution (25 mg/mL). The mixture was sealed under a nitrogen atmosphere. Then it was put under ultrasonic environment for 5 min to make the mixture blended thoroughly. The purple suspension was stirred for 48 h at 35 °C in the dark, and then dried in a vacuum concentrator. The dried residue was redissolved in water and filtered under vacuum. The orange filtrate was frozen and then lyophilized (Labconco Freeze Dry System/Freezone 4.5, Labconco, Kansas City, MO, USA).

2.3. Storage stability

The inclusion complex was dissolved in water (2.65 μg/mL). Astaxanthin was dissolved in acetone/n-hexane (1:1, v/v, 3.28 μg/mL). The samples were put into amber glass bottle and blanketed with N2. Then, the samples were divided into two groups and stored at 4 °C and 25 °C in dark incubators. Absorbance of the samples was measured at 480 nm every 24 h. Each test was repeated at least three times.

2.4. Antioxidant activity

2.4.1. Reducing power

Reducing power was determined according to the method described by Siddhuraju and Becker (Siddhuraju & Becker, 2003). 0.5 mL of sample solution (astaxanthin and astaxanthin/HPCD inclusion complex, ascorbic acid was employed as a control sample) at various concentrations were mixed with 2.5 mL of phosphate buffer (0.2 M, pH 6.6) and 2.5 mL of potassium ferricyanide (1.0%, w/v). The mixture was incubated at 50 °C for 20 min, and then cooled rapidly. 2.5 mL of trichloroacetic acid (10.0%, w/v) was added to the mixture, which was then centrifuged at 4000 rpm for 10 min. 2.5 mL of upper layer of the solution was taken out and mixed with 2.5 mL of deionized water and 0.5 mL of ferric chloride (0.1%, w/v), the mixture was stood for 10 min, then the absorbance was measured at 700 nm by a 2100 UV–VIS spectroscopy (Unico, Shanghai, China).

2.4.2. DPPH radical scavenging activity

The 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) radical scavenging activity of astaxanthin/HPCD inclusion complex was measured using the method of Gülçin, Küfrevioğlu, Oktay, and Büyükokuroğlu (2004) with some modifications. 0.1 mM solution of DPPH in ethanol was prepared. Then, 2 mL of this solution was added to 2 mL of sample solutions at different concentrations. The mixture was shaken and allowed to stand at 25 °C for 30 min. The absorbance was measured at 517 nm in 2100 UV–VIS spectroscopy. Lower absorbance of the reaction mixture indicated higher free radical scavenging activity. The DPPH scavenging effect (KD) was calculated using the following equation:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีภัณฑ์Astaxanthin (บริสุทธิ์ > 98%) ถูกซื้อจากซิก-Aldrich บริษัท LLC (เซี่ยงไฮ้ จีน) HP-β-ซีดี (ความบริสุทธิ์ > 99%, DS = 5.5) ซื้อจาก Wako เพียวเคมีอุตสาหกรรม จำกัด (Chuoku โอซาก้า ญี่ปุ่น) Astaxanthin/HPCD รวมซับซ้อนถูกเตรียมในห้องปฏิบัติการของเราเอง Reagents อื่น ๆ เกรดวิเคราะห์ได้ น้ำที่ใช้ได้คู่กลั่น และ deionized2.2 การเตรียมการของ astaxanthin/HPCD รวมที่ซับซ้อนastaxanthin 10 มิลลิกรัมละลายใน dichloromethane 10 mL และเพิ่ม 40 mL HPCD เมทานอลโซลูชั่น (25 mg/mL) ส่วนผสมถูกปิดผนึกภายใต้บรรยากาศไนโตรเจน แล้ว มันถูกวางภายใต้สภาพแวดล้อมอัลตราโซนิก 5 นาทีเพื่อให้ส่วนผสมที่ผสมอย่างละเอียด การระงับสีม่วงกวนสำหรับ h 48 ที่ 35 ° C ในมืด และอบแห้งในอาทิตย์หัวสิว สารตกค้างแห้ง redissolved น้ำ และกรองภายใต้สุญญากาศ สารกรองส้มถูกแช่แข็งแล้ว lyophilized (Labconco ตรึงแห้ง ระบบ/Freezone 4.5, Labconco แคนซัสซิตี้ MO สหรัฐอเมริกา)2.3 การเก็บความมั่นคงรวมที่ซับซ้อนคือละลายในน้ำ (2.65 μg/mL) Astaxanthin เป็นละลายในอะซิโตน/เอ็นเฮกเซน (1:1, v/v, 3.28 μg/mL) ตัวอย่างถูกใส่ลงในขวดแก้วสีเหลืองอำพัน และปกคลุม ด้วย N2 แล้ว ตัวอย่างถูกแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม และเก็บที่ 4 ° C และ 25 ° C ในผลิตและมืด มีวัด absorbance ของตัวอย่างที่ 480 nm ทุก 24 ชม ทดสอบแต่ละไม่ซ้ำน้อยสามครั้ง2.4. Antioxidant activity2.4.1. Reducing powerReducing power was determined according to the method described by Siddhuraju and Becker (Siddhuraju & Becker, 2003). 0.5 mL of sample solution (astaxanthin and astaxanthin/HPCD inclusion complex, ascorbic acid was employed as a control sample) at various concentrations were mixed with 2.5 mL of phosphate buffer (0.2 M, pH 6.6) and 2.5 mL of potassium ferricyanide (1.0%, w/v). The mixture was incubated at 50 °C for 20 min, and then cooled rapidly. 2.5 mL of trichloroacetic acid (10.0%, w/v) was added to the mixture, which was then centrifuged at 4000 rpm for 10 min. 2.5 mL of upper layer of the solution was taken out and mixed with 2.5 mL of deionized water and 0.5 mL of ferric chloride (0.1%, w/v), the mixture was stood for 10 min, then the absorbance was measured at 700 nm by a 2100 UV–VIS spectroscopy (Unico, Shanghai, China).2.4.2. DPPH radical scavenging activity1.1 ฟีนิลได-2-picryl-hydrazil (DPPH) รุนแรง scavenging กิจกรรมของ astaxanthin/HPCD รวมซับซ้อนถูกวัดโดยใช้วิธีการของ Gülçin, Küfrevioğlu, Oktay และ Büyükokuroğlu (2004) มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง มีเตรียม 0.1 มม.โซลูชันของ DPPH ในเอทานอล , 2 mL ของโซลูชันนี้ถูกเพิ่มไป 2 มล.ของตัวอย่างการแก้ปัญหาที่ความเข้มข้นแตกต่างกันด้วย ส่วนผสมถูกเขย่า และอนุญาตให้ยืนที่ 25 ° C สำหรับ 30 นาที มีที่วัด absorbance ที่ 517 nm ใน 2100 ก UV – VIS Absorbance ล่างของผสมปฏิกิริยาระบุกิจกรรม scavenging อนุมูลอิสระสูง DPPH scavenging ผล (KD) ถูกคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีAstaxanthin (ความบริสุทธิ์> 98%) ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich จำกัด LLC (เซี่ยงไฮ้) HP-β-CD (ความบริสุทธิ์> 99%, DS = 5.5) ซื้อมาจากอุตสาหกรรมเคมี Wako บริสุทธิ์ จำกัด (Chuoku โอซาก้าประเทศญี่ปุ่น) Astaxanthin / HPCD ซับซ้อนรวมถูกจัดทำขึ้นในห้องปฏิบัติการของเราเอง ทั้งหมดน้ำยาอื่น ๆ ของเกรดวิเคราะห์ น้ำที่ใช้ถูกกลั่นคู่และปราศจากไอออน. 2.2 เตรียมความพร้อมของ astaxanthin / HPCD ซับซ้อนรวม10 มิลลิกรัม astaxanthin ถูกละลายใน 10 มิลลิลิตรไดคลอโรมีเทนและเพิ่มถึง 40 มิลลิลิตร HPCD แก้ปัญหาเมทานอล (25 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ส่วนผสมที่ถูกปิดผนึกไว้ภายใต้บรรยากาศไนโตรเจน จากนั้นก็จะถูกนำภายใต้สภาพแวดล้อมอัลตราโซนิกเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อให้ส่วนผสมปั่นให้ละเอียด ระงับสีม่วงถูกกวนเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 35 องศาเซลเซียสในที่มืดและแห้งแล้วในหัวสูญญากาศ ที่เหลือแห้ง redissolved ในน้ำและกรองสูญญากาศ กรองสีส้มถูกแช่แข็งและแห้งแล้ว (Labconco ตรึงระบบแห้ง / Freezone 4.5 Labconco, แคนซัสซิตี, สหรัฐอเมริกา). 2.3 การเก็บรักษาที่ซับซ้อนรวมที่ได้รับการละลายในน้ำ (2.65 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) Astaxanthin ถูกละลายในอะซีโตน / n-เฮกเซน (1: 1, v / V 3.28 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) กลุ่มตัวอย่างที่ถูกใส่ลงไปในขวดแก้วสีเหลืองอำพันและปกคลุมด้วย N2 จากนั้นกลุ่มตัวอย่างถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่มและเก็บไว้ที่ 4 ° C ถึง 25 ° C ในตู้อบที่มืด การดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวัดที่ 480 นาโนเมตรทุก 24 ชั่วโมง ทดสอบแต่ละซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง. 2.4 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ2.4.1 การลดการใช้พลังงานลดการใช้พลังงานได้รับการพิจารณาตามวิธีการที่อธิบายโดย Siddhuraju และเบกเกอร์ (Siddhuraju & Becker, 2003) 0.5 มิลลิลิตรของสารละลายตัวอย่าง (astaxanthin และ astaxanthin / HPCD ซับซ้อนรวมวิตามินซีถูกจ้างมาเป็นตัวอย่างควบคุม) ที่ระดับความเข้มข้นต่าง ๆ ผสมกับ 2.5 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.2 M ค่า pH 6.6) และ 2.5 มิลลิลิตรของโพแทสเซียม ferricyanide (1.0% , w / v) ส่วนผสมที่ถูกบ่มที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีและจากนั้นเย็นลงอย่างรวดเร็ว 2.5 มิลลิลิตรของกรดไตรคลอโร (10.0% w / v) ถูกบันทึกอยู่ในส่วนผสมซึ่งได้รับการหมุนเหวี่ยงแล้วที่ 4000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที 2.5 มิลลิลิตรชั้นบนของการแก้ปัญหาที่ถูกนำออกมาและผสมกับ 2.5 มิลลิลิตรน้ำปราศจากไอออนและ 0.5 มิลลิลิตรคลอไรด์เฟอริก (0.1% w / v) ส่วนผสมที่ถูกยืนเป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นดูดกลืนแสงวัดที่ 700 นาโนเมตร โดยสเปคโทร 2100 UV-VIS (ยูนิโก้, เซี่ยงไฮ้, จีน). 2.4.2 DPPH กิจกรรมต้านอนุมูล1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) ต้านอนุมูลอิสระแอสตาแซ / HPCD ซับซ้อนรวมวัดโดยใช้วิธีการของGülçin, Küfrevioğlu, Oktay และBüyükokuroğlu (2004) มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง 0.1 มิลลิแก้ปัญหาของ DPPH ในเอทานอลถูกจัดทำขึ้น จากนั้น 2 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหานี้ถูกบันทึกอยู่ใน 2 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาตัวอย่างที่ระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกัน ส่วนผสมที่ถูกเขย่าและได้รับอนุญาตให้อยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที การดูดกลืนแสงวัดที่ 517 นาโนเมตร 2100 สเปคโทร UV-VIS การดูดกลืนแสงที่ต่ำกว่าของผสมปฏิกิริยาที่ระบุต้านอนุมูลอิสระสูง ผลไล่ DPPH (KD) ที่คำนวณโดยใช้สมการดังต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . เคมีภัณฑ์แอสตาแซนทิน ( ความบริสุทธิ์ > 98% ) ซื้อมาจาก Sigma –ดิช Co . LLC ( เซี่ยงไฮ้ , จีน ) HP - บีตา - ซีดี ( ความบริสุทธิ์ > 99% , DS = 5.5 ) ซื้อจาก Wako เพียว เคมีอุตสาหกรรม จำกัด ( chuoku , โอซาก้า , ญี่ปุ่น แอสตาแซนธิน / hpcd รวมซับซ้อนถูกเตรียมไว้ในแล็บของเราเอง สารเคมีอื่น ๆทั้งหมดถูกวิเคราะห์เกรด น้ำที่ใช้เป็นคู่ กลั่น และคล้ายเนื้อเยื่อประสาน .2.2 . การเตรียมการของแอสตาแซนทิน / hpcd รวมที่ซับซ้อน10 มิลลิกรัมแอสทาแซนทินถูกละลายใน 10 มล ไดคลอโรมีเทน และเพิ่ม 40 ml hpcd อล โซลูชั่น ( 25 mg / ml ) ส่วนผสมจะถูกเก็บไว้ภายใต้บรรยากาศไนโตรเจน แล้วมันใส่ภายใต้สภาพแวดล้อม ultrasonic เป็นเวลา 5 นาที เพื่อให้ส่วนผสมที่ผสมอย่างทั่วถึง การระงับสีม่วงถูกกวน 48 H 35 ° C ในที่มืดและแห้งในสูญญากาศหัว . ที่ตกค้างในน้ำและแห้ง redissolved กรองสุญญากาศ 148 ส้มแช่แข็งและแห้ง ( แล็บคอนโก้หยุดบริการระบบ / freezone 4.5 , แล็บคอนโก้ , แคนซัสซิตีโม , USA )2.3 เสถียรภาพกระเป๋ารวมที่ละลายในน้ำ ( 2.65 μ g / ml ) แอสตาแซนทินถูกละลายในอะซิโตน / บีบ ( 1 : 1 v / v 3.28 μ g / ml ) จำนวนใส่ลงในขวดแก้วสีชา และปกคลุมไปด้วย 2 . จากนั้น แบ่งกลุ่มตัวอย่างออกเป็น 2 กลุ่ม และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C และ 25 ° C ในที่มืดและ . การดูดกลืนแสงของตัวอย่างถูกวัดที่ 480 nm ทุก 24 ชั่วโมง ทำการทดสอบกันอย่างน้อยสามครั้ง2.4 . กิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระเครื่องมือกำจัดเพื่อย้าย . การลดพลังงานการลดใช้พลังงานถูกกำหนดตามวิธีการและอธิบายโดย siddhuraju เบคเกอร์ ( siddhuraju & Becker , 2003 ) ตัวอย่างของโซลูชั่น 0.5 มล. ( แอสตาแซนธินและแอสทาแซนทิน / hpcd รวมที่ซับซ้อน , กรดแอสคอร์บิกเป็นพนักงานควบคุมตัวอย่าง ) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆผสมกับ 2.5 มิลลิลิตร ( 0.2 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.6 ) และ 2.5 กรัมโพแทสเซียมเฟอร์ริกไซนาไนด์ ( 1.0 % W / V ) ส่วนผสมจะถูกบ่มที่อุณหภูมิ 50 องศา C เป็นเวลา 20 นาทีและจากนั้นเย็นอย่างรวดเร็ว 2.5 มิลลิลิตรของกรดไตรคลอโรอะซิติก ( 10.0 % W / V ) ถูกเพิ่มลงในส่วนผสม ซึ่งเป็นระดับที่ 4 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที 2.5 ml ของชั้นบนของโซลูชั่นที่นำออกมาผสมกับ 2.5 มล. ของน้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสานและเฟอร์ริคคลอไรด์ 0.5 มล. ( 0.1 % W / V ) ผสมยืนเป็นเวลา 10 นาที แล้วทำการวัดค่าการดูดกลืนแสงยูวี - 700 nm โดย 2100 vis spectroscopy ( จีน ยูนิโก้ , เซี่ยงไฮ้ , )2.4.2 . dpph เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา กิจกรรมการ 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil ( dpph ) เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา กิจกรรมของแอสตาแซนทิน / hpcd รวมซับซ้อนถูกวัดโดยใช้วิธี G ü k ü l 5 , frevio ğลู่ oktay และ B ü y ü kokuro ğลู่ ( 2004 ) มีการปรับเปลี่ยน 0.1 มม. dpph ในสารละลายเอทานอลที่เตรียมไว้ จากนั้น 2 มิลลิลิตรของสารละลายนี้ ได้เพิ่ม 2 มล ตัวอย่างของโซลูชั่นที่ความเข้มข้นต่างๆ ส่วนผสมจะถูกสั่นคลอน และได้รับอนุญาตให้ยืนที่ 25 ° C เป็นเวลา 30 นาที นวัดที่ 517 nm ใน 2100 – UV VIS spectroscopy . ลดการดูดกลืนแสงของปฏิกิริยาผสม พบสูงกำจัดอนุมูลอิสระ . การ dpph scavenging effect ( Kd ) คำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้