RNA extraction and cDNA synthesisWa

RNA extraction and cDNA synthesis
Water samples were filtered through electropositive
Virosorb 1 MDS cartridges (CUNO, Meriden, CO). Once
water samples were concentrated to a 30 mL volume, RNA
was extracted using a Trizol LS reagent (Invitrogen,
Carlsbad, CA) and chloroform. Aliquots of 300 μL of
water were mixed with 300 μL of PBS 1× and shaken vigorously
five times, leaving the vials on ice for one minute
between each shaking, and then centrifuged at 12,000 × g
for five minutes. The upper phase containing RNA was
transferred and 500 μL of Trizol added, gently mixing for
one minute before replacing on ice. This procedure was
repeated five times. Subsequently, 100 μL of chloroform
was added gently and shaken vigorously five times.
Following centrifugation at 12,000 × g for five minutes,
the upper phase was recovered and incubated with the
same volume of isopropanol at 4°C for 30 minutes, and
then centrifuged for 15 minutes at 12,000 × g at 4°C. The
pellet was washed with 1 mL of absolute ethanol and centrifuged
for a further five minutes at 12,000 × g at 4°C.
Finally, the pellet was dried at room temperature and resuspended
in 20 μL RNAse free water, and stored at -70°C
until RT-PCR analysis took place.
cDNA synthesis (RT reaction) was performed in a 20 μL
reaction volume containing 1 μL of RNA, 1 μL of 5 pM
primer, and 9.9 μL nuclease-free water (Invitrogen,
Carlsbad, CA) at 70°C for 10 minutes. Subsequently, 8.1
μL of a mix containing 4 μL of 5× first strand buffer [250
mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2], 2 μL
0.1 M DTT, 2 μL 5 mM dNTPs and 20 U Super Script II
reverse transcriptase (Invitrogen) was added. The reaction
was carried out at 42°C for one hour and subsequently at
70°C for 15 minutes.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สกัด RNA
และการสังเคราะห์ยีนตัวอย่างน้ำถูกกรองผ่านelectropositive
Virosorb 1 ตลับ MDS (คูโน่, เมริเดน CO) เมื่อตัวอย่างน้ำมีความเข้มข้นปริมาณมล 30 RNA ถูกสกัดโดยใช้น้ำยา Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) และคลอโรฟอร์ม aliquots 300 ไมโครลิตรของน้ำผสมกับ300 ไมโครลิตรของพีบีเอส 1 ×และเขย่าแรง ๆครั้งที่ห้าออกจากขวดบนน้ำแข็งเป็นเวลาหนึ่งนาทีระหว่างกันสั่นและหมุนเหวี่ยงแล้วที่ 12,000 ×กรัมห้านาที ขั้นตอนบนที่มีอาร์เอ็นเอได้รับการโอนและ 500 ไมโครลิตรของ Trizol เพิ่มเบา ๆ ผสมหนึ่งนาทีก่อนที่จะเปลี่ยนบนน้ำแข็ง ขั้นตอนนี้จะถูกทำซ้ำห้าครั้ง ต่อมา 100 ไมโครลิตรคลอโรฟอร์มถูกเพิ่มเข้ามาอย่างอ่อนโยนและเขย่าแรงๆ ห้าครั้ง. หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมสำหรับห้านาทีขั้นตอนบนได้รับการกู้คืนและบ่มกับปริมาณเดียวกันของisopropanol ที่ 4 ° C เป็นเวลา 30 นาทีและปั่นแล้ว15 นาทีที่ 12,000 ×กรัมที่ 4 ° C เม็ดถูกล้างด้วย 1 มิลลิลิตรของเอทานอลแน่นอนและหมุนเหวี่ยงอีกห้านาทีที่12,000 ×กรัมที่ 4 ° C. สุดท้ายเม็ดแห้งที่อุณหภูมิห้องและ resuspended ใน 20 ไมโครลิตร RNase น้ำฟรีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 ° C จนการวิเคราะห์ RT-PCR ที่เกิดขึ้น. การสังเคราะห์ยีน (RT ปฏิกิริยา) ได้ดำเนินการในไมโครลิตร 20 ปริมาณปฏิกิริยาที่มี 1 ไมโครลิตรของอาร์เอ็นเอ 1 ไมโครลิตรของ 05:00 ไพรเมอร์และน้ำ Nuclease ฟรีไมโครลิตร 9.9 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ต่อมา 8.1 ไมโครลิตรของผสมที่มี 4 ไมโครลิตร 5 ×บัฟเฟอร์สาระแรก [250 มิลลิ Tris-HCl (pH 8.3) 375 มิลลิ KCl 15 มิลลิ MgCl2] 2 ไมโครลิตร0.1 M DTT 2 ไมโครลิตร 5 มิลลิ dNTPs และ 20 U ซูเปอร์สคริปที่สองtranscriptase ย้อนกลับ (Invitrogen) ถูกเพิ่มเข้ามา ปฏิกิริยาที่ได้ดำเนินการที่ 42 ° C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงและต่อมาที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัด DNA และตัวอย่างน้ำถูกกรองผ่านการสังเคราะห์ cDNA ซึ่งมีประจุไฟฟ้าบวก

virosorb 1 ตลับ ( cuno Meriden , MDS , Co ) เมื่อ
น้ำยังเข้มข้น 30 มล. ปริมาณ RNA
ถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ trizol LS ( Invitrogen
, Carlsbad , CA ) และคลอโรฟอร์ม เฉยๆของ 300 μ l
น้ำผสม 300 μ L ของ PBS 1 ×และหวั่นไหวชะมัด
5 ครั้งออกจากขวดน้ำแข็ง 1 นาที
ระหว่างกันสั่น แล้วไฟฟ้าที่ 12000 × g
5 นาที บนเฟสที่มี RNA คือ
โอน 500 μ l trizol เพิ่ม ค่อยๆผสมสำหรับ
1 นาทีก่อนที่จะเปลี่ยนบนน้ำแข็ง ขั้นตอนนี้คือ
ซ้ำห้าครั้ง จำนวน 100 μชั้นคลอโรฟอร์มได้เพิ่ม และค่อย ๆเขย่าอย่างแรง

ห้าครั้งต่อไปนี้การปั่นเหวี่ยงที่ 12000 × g 5 นาที
เฟสบนถูกกู้คืนและบ่มด้วย
เดียวกันปริมาณไอโซโพรพานอล 4 ° C เป็นเวลา 30 นาที และ 15 นาที
แล้วระดับที่ 12 × G ที่ 4 องศา
เม็ดซัก 1 มิลลิลิตรเอทานอลและไฟฟ้า
สำหรับสัมบูรณ์ อีกห้านาทีที่ 12 × G ที่ 4 องศา
ในที่สุดเม็ดแห้งได้ในอุณหภูมิห้อง และ resuspended
20 μน้ำผมเลสฟรีและเก็บที่อุณหภูมิ - 70 องศา C
จนถึงการวิเคราะห์นี้เกิดขึ้น .
การสังเคราะห์ cDNA ( ปฏิกิริยา RT ) แสดงใน 20 μ L
ปฏิกิริยาปริมาณบรรจุ 1 ลิตรμ RNA 1 μลิตร 5 โมงเย็น
ไพรเมอร์ และ 9.9 μลิตรนิวเคลียสฟรีน้ำ ( Invitrogen
, Carlsbad , CA ) ที่ 70 องศา C เป็นเวลา 10 นาที 8.1
เมื่อμลิตรผสมที่ประกอบด้วย 4 μ L 5 × 1 เส้นจากบัฟเฟอร์ [ HCL 250
มม. ( pH 8.3 ) . 375 มม. , 15 มม. ชุด ] 2 μ L
0.1 M ส่วน 2 μ L 5 มม. และ dntps transcriptase กลับ 20 U Super สคริปต์ II
( Invitrogen ) ถูกเพิ่มเข้ามา ปฏิกิริยา
ถูกดำเนินการที่ 42 ° C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง และภายหลังที่
70 ° C เป็นเวลา 15 นาที