Serial cross sections (10 μm thick)

Serial cross sections (10 μm thick) were cut on a cryostat at − 25 °C and stained using the NADH-tetrazolium stain to determine oxidative capacity of the muscle (Novikoff et al., 1961). On separate sections, types I and II fibers were visualized using ATPase stability at alkaline pH 10.3 (Brooke and Kaiser, 1970).

Immunohistochemistry was performed by incubating sections with the specific MHC antibodies as described by Smith et al. (2008), but with modifications. Briefly, sections were fixed in pre-chilled methanol for 10 min at − 20 °C and hydrated in 0.05% Tween 20 phosphate buffered saline, pH 7.40 (PBS-T). Sections were then blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) in PBS-T for 1 h at room temperature in a humidified chamber. Primary antibodies diluted 1:25 in PBS-T were added to the sections and incubated overnight at 4 °C in the dark. The following day, the sections were washed twice in PBS-T for 2 min and incubated with horseradish peroxidase conjugated secondary rabbit anti-mouse antibody (1:50 diluted in PBS-T) for 1 h at room temperature. After washing twice in PBS-T for 5 min, the immuno-reactive sites were visualized using the peroxidase DAB substrate kit (DAKO Laboratories, Denmark). After adequate washing, the sections were mounted with DPX (BDH Laboratories).

All sections were inspected under a microscope (PrimoStar, Carl Zeiss MicroImaging, Germany) and photographed using a CMOS camera. Fibers were classified as types I, IIa and IIx according to the intensity profile of the ATPase, NADH and immunohistochemical stained sections. Hybrid fibers were disregarded as they represented less than 1% of the total number of fibers analyzed. After fiber identification, CSA (μm2) of each was determined on the pH 10.3 slides using pre-calibrated software

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนขนประจำ (10 μm หนา) ถูกตัดบน cryostat ที่− 25 ° C และสีใช้คราบ NADH tetrazolium เพื่อกำหนดกำลังการผลิต oxidative ของกล้ามเนื้อ (Novikoff et al., 1961) ในส่วนแยก ชนิดของเส้นใย II และฉันมี visualized ใช้เสถียรภาพ ATPase ที่ด่าง pH 10.3 (บรูคและนิคม 1970)Immunohistochemistry ถูกทำ โดย incubating กับแอนตี้เอ็มเอชซีเฉพาะส่วนตามที่อธิบายไว้โดย Smith et al. (2008), แต่ มีการปรับเปลี่ยน สั้น ๆ ส่วนที่ถาวรในเมทานอลก่อนเย็นสำหรับ 10 นาทีที่ 20 ° C − และ hydrated ใน 0.05% Tween 20 ฟอสเฟต buffered saline, pH 7.40 (PBS-T) ส่วนได้แล้วถูกบล็อค ด้วย 5% วัว serum albumin (บีเอสเอ) ใน PBS T สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องในหอ humidified แอนตี้หลักแตกออก 1:25 ใน PBS T ถูกเพิ่มส่วน และ incubated ค้างคืนที่ 4 ° C ในมืด วันต่อไปนี้ ส่วนถูกล้างสองครั้งใน PBS-T สำหรับ 2 นาที และ incubated กับ horseradish peroxidase กระต่ายกลวงรองเมาส์ต่อต้านแอนติบอดี (1:50 ยกเว้นใน PBS-T) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากซักสองครั้งใน PBS-T สำหรับ 5 นาที ไซต์ immuno ปฏิกิริยามี visualized ใช้ peroxidase เล็กน้อยพื้นผิวชุด (ห้องปฏิบัติการ DAKO เดนมาร์ก) หลังจากซักผ้าเพียงพอ ส่วนที่ติดกับ DPX (BDH Laboratories)ส่วนทั้งหมดถูกตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ (PrimoStar, Carl Zeiss MicroImaging เยอรมนี) และถ่ายภาพโดยใช้กล้อง CMOS เส้นใยถูกจัดประเภทเป็นประเภท I, IIa และ IIx ตามค่าความเข้มของ ATPase, NADH และ immunohistochemical สีส่วน ผสมเส้นใยถูกละเว้น ตามที่พวกเขาแสดงน้อยกว่า 1% ของจำนวนเส้นใยที่วิเคราะห์ หลังไฟเบอร์รหัส CSA (μm2) ของแต่ละคนถูกกำหนดบนภาพนิ่ง pH 10.3 ใช้ซอฟต์แวร์การปรับเทียบก่อน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ส่วนข้ามอนุกรม ( ม. หนา 10  μ ) ถูกตัดใน Cryostat ที่−  25  ° C และเปื้อนคราบ tetrazolium โดยใช้การกำหนดความจุออกซิเดชันของกล้ามเนื้อ ( novikoff et al . , 1961 ) ใน แยก ส่วน ประเภท I และ II เส้นใยโดยใช้ผลที่มองเห็นความด่าง pH 10.3 ( บรูค และ ไกเซอร์ , 1970 ) .

หลอดได้โดยการแช่ส่วนที่มีแอนติบอดี MHC เฉพาะตามที่อธิบายไว้โดย Smith et al . ( 2008 ) แต่ด้วยการปรับเปลี่ยน สั้น ๆ , ส่วนที่ถูกแก้ไขในเมทานอลก่อนแช่เย็น 10 รึเปล่า นาทีที่−  20  ° C และ hydrated 0.05 tween 20 ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7.40 ( น้ําเกลือ , pbs-t )ส่วนที่เป็นบล็อกด้วย 5 % ( BSA ) ในซีรั่มอัลบูมิวัว pbs-t 1 ไหม H ที่อุณหภูมิห้องใน humidified Chamber แอนติบอดีในการเจือจาง 1 : 25 pbs-t ถูกเพิ่มไปยังส่วนที่บ่มค้างคืนที่ 4  °องศาเซลเซียสในที่มืด วันต่อ ๆไปส่วนที่ถูกล้างสองครั้งใน pbs-t 2 นาทีและบ่มด้วย horseradish peroxidase  และระดับแอนติบอดีต่อต้านเมาส์กระต่าย ( 1 : 50 ซึ่งใน pbs-t ) 1 รึเปล่าชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างสองครั้งใน pbs-t 5 มั้ย มิน มมูโนไซต์ได้มองเห็นการเปลี่ยนแปลงปฏิกิริยาแตะพื้นผิว Kit ( ทางหนึ่งห้องปฏิบัติการ , เดนมาร์ก ) หลังจากล้างหน้า เพียงพอส่วนที่ติดกับ dpx ( bdh ห้องปฏิบัติการ )

ส่วนทั้งหมดถูกตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ( primostar , Carl Zeiss microimaging , เยอรมนี ) และถ่ายภาพโดยใช้กล้อง CMOS เส้นใยแบ่งเป็นประเภทฉัน และ iix จัดขึ้นตามความเข้มโปรไฟล์ของ ATPase และการย้อมสี , ในส่วนเส้นใยลูกผสมถูกปัดเป็นพวกเขาเป็นตัวแทนน้อยกว่า 1% ของจำนวนของเส้นใยวิเคราะห์ หลังจากประชาชนไฟเบอร์ , CSA ( μ M2 ) ของแต่ละคนถูกกำหนดไว้บนสไลด์ก่อนปรับใช้ซอฟต์แวร์อ