Purification of protease Dried frui

Purification of protease Dried fruiting bodies of C. sobolifera mushrooms (25 g) were homogenized and extracted overnight in 0.15 M NaCl at 4°C. The homogenate was centrifuged at 8000×g for 20 min, and then (NH4)2SO4 was added to the supernatant to 70% saturation. Four hours later, the precipitate was collected by centrifugation at 6000×g for 30 min. The precipitate was dissolved and dialyzed to remove (NH4)2SO4 before loading onto an anion-exchange column (2.5×20 cm) of DEAE-cellulose pre-equilibrated with 10 mM NH4HCO3 buffer (pH 9.4). The column was eluted with the same buffer. After removal of the unadsorbed peak (fraction D1) containing strong protease activity, two adsorbed peaks, fractions D2 and D3 were eluted with 100 mM and 1 M NaCl, respectively, in the starting buffer. The active fraction (D1) was next subjected to a cation-exchange column (1.0×15 cm) of SP- Sepharose pre-equilibrated in 10 mM citric acid buffer (pH 5.0). After removal of unadsorbed proteins (fraction SP1), the column was eluted with a linear concentration gradient of 0–800 mM NaCl in 10 mM citric acid buffer (pH 5.0) to obtain adsorbed proteins (fractions SP2 and SP3). The active fraction (SP3) with protease activity was subsequently purified on a Superdex 75 HR 10/30 column in 0.15 M NH4HCO3 buffer (pH 8.5) by fast protein liquid chromatography (FPLC) using an AKTA Purifier (GE Healthcare). The first fraction (SU1) contained the purified protease.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บริสุทธิ์ของโปรติเอสแห้ง fruiting C. sobolifera เห็ด (25 กรัม) homogenized และขยายค้างคืนใน 0.15 M NaCl ที่ 4 องศาเซลเซียส Homogenate การแก้ไขผลิตภัณฑ์ที่ 8000 × g 20 นาที และจากนั้น ถูก (NH4) 2SO4 supernatant 70% อิ่มตัว สี่ชั่วโมงต่อมา ตะกอนถูกรวบรวม โดยหมุนเหวี่ยงที่ 6000 × g สำหรับ 30 นาที ตะกอนถูกละลาย และ dialyzed การเอา (NH4) 2SO4 ก่อนที่จะโหลดลงในคอลัมน์ที่มีการแลกเปลี่ยนไอออน (2.5 × 20 ซม.) DEAE-เซลลูโลสล่วงหน้า equilibrated กับ 10 มม. NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 9.4) คอลัมน์ถูก eluted กับบัฟเฟอร์ที่เดียวกัน หลังจากกำจัดโรงกิจกรรมสูงสุด unadsorbed (เศษส่วน D1) ที่มีโปรติเอสที่แข็งแกร่ง ซับสองยอด เศษส่วน D2 และ D3 ได้ eluted 100 mM และ 1 M NaCl ตามลำดับ ในบัฟเฟอร์เริ่มต้น ส่วนที่ใช้งาน (D1) ถัดไปภายใต้การแลกเปลี่ยนคอลัมน์ (1.0 × 15 ซม.) ของ SP Sepharose ก่อน equilibrated ในบัฟเฟอร์กรด 10 มม. (pH 5.0) หลังจากกำจัดโปรตีน unadsorbed (เศษส่วน SP1), คอลัมน์ eluted กับการไล่โทนความเข้มข้นเชิงเส้น 0 – 800 มม. NaCl 10 มม.บัฟเฟอร์กรด (pH 5.0) เพื่อขอรับซับโปรตีน (เศษส่วน SP2 และ SP3) ส่วนที่ใช้งาน (SP3) กับกิจกรรมโปรติเอสมาบริสุทธิ์บน Superdex 75 ชั่วโมง 10/30 คอลัมน์ใน 0.15 M NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 8.5) โดยโปรตีนอย่างรวดเร็วของเหลว chromatography (FPLC) โดยใช้เครื่องฟอก AKTA (GE สุขภาพ) ส่วนแรก (SU1) ประกอบด้วยโปรติเอสบริสุทธิ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของน้ำย่อยแห้งดอกเห็ดเห็ดซี sobolifera (25 กรัม) มีหดหายและสกัดค้างคืนใน 0.15 M NaCl ที่ 4 ° C homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีแล้ว (NH4) 2SO4 ถูกเพิ่มลงในสารละลายอิ่มตัวถึง 70% สี่ชั่วโมงต่อมาตะกอนที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 6000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาที ตะกอนก็เลือนหายไปและ dialyzed จะลบ (NH4) 2SO4 ก่อนที่จะโหลดลงในคอลัมน์ไอออนแลกเปลี่ยน (2.5 × 20 เซนติเมตร) DEAE-เซลลูโลสก่อน equilibrated 10 มิลลิ NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 9.4) คอลัมน์นี้ถูกชะด้วยบัฟเฟอร์เดียวกัน หลังจากที่การกำจัดของยอด unadsorbed (ส่วน D1) ที่มีกิจกรรมโปรติเอสที่แข็งแกร่งสองดูดซับยอดเศษส่วน D2 และ D3 ถูกชะกับ 100 มิลลิเมตร 1 เมตรโซเดียมคลอไรด์ตามลำดับในบัฟเฟอร์เริ่มต้น ส่วนที่ใช้งาน (D1) เป็นต่อไปภายใต้คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน (1.0 × 15 เซนติเมตร) SP- Sepharose ก่อน equilibrated ใน 10 มิลลิบัฟเฟอร์กรดซิตริก (pH 5.0) หลังจากที่กำจัดของโปรตีน unadsorbed (เศษ SP1) คอลัมน์ที่ถูกชะด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นเชิงเส้นของ 0-800 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ในขนาด 10 MM บัฟเฟอร์กรดซิตริก (pH 5.0) เพื่อให้ได้โปรตีนที่ดูดซับ (เศษส่วน SP2 และ SP3) ส่วนที่ใช้งาน (SP3) กับกิจกรรมโปรติเอสบริสุทธิ์ต่อมาใน Superdex 75 HR 10/30 คอลัมน์ 0.15 M NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 8.5) โดยโปรตีนอย่างรวดเร็วของเหลว chromatography (FPLC) โดยใช้เครื่องฟอก AKTA (GE Healthcare) ส่วนแรก (SU1) บรรจุน้ำย่อยบริสุทธิ์ คอลัมน์ที่ถูกชะด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นเชิงเส้นของ 0-800 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ในขนาด 10 MM บัฟเฟอร์กรดซิตริก (pH 5.0) เพื่อให้ได้โปรตีนที่ดูดซับ (เศษส่วน SP2 และ SP3) ส่วนที่ใช้งาน (SP3) กับกิจกรรมโปรติเอสบริสุทธิ์ต่อมาใน Superdex 75 HR 10/30 คอลัมน์ 0.15 M NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 8.5) โดยโปรตีนอย่างรวดเร็วของเหลว chromatography (FPLC) โดยใช้เครื่องฟอก AKTA (GE Healthcare) ส่วนแรก (SU1) บรรจุน้ำย่อยบริสุทธิ์ คอลัมน์ที่ถูกชะด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นเชิงเส้นของ 0-800 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ในขนาด 10 MM บัฟเฟอร์กรดซิตริก (pH 5.0) เพื่อให้ได้โปรตีนที่ดูดซับ (เศษส่วน SP2 และ SP3) ส่วนที่ใช้งาน (SP3) กับกิจกรรมโปรติเอสบริสุทธิ์ต่อมาใน Superdex 75 HR 10/30 คอลัมน์ 0.15 M NH4HCO3 บัฟเฟอร์ (pH 8.5) โดยโปรตีนอย่างรวดเร็วของเหลว chromatography (FPLC) โดยใช้เครื่องฟอก AKTA (GE Healthcare) ส่วนแรก (SU1) บรรจุน้ำย่อยบริสุทธิ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลิตโปรตีเอสแห้งติดร่างของซี sobolifera เห็ด ( 25 กรัม ) ถูกบดและสกัดค้างคืน 0.15 M NaCl ที่ 4 ° C แยกเป็นระดับที่ 8 × G สำหรับ 20 นาทีและ ( NH4 ) 2so4 เพิ่มให้สูงถึง 70% ของความอิ่มตัว สี่ชั่วโมงต่อมา ที่รวบรวมได้จากการปั่นเหวี่ยงที่ 6000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาที ที่ถูกละลายและผ่านเพื่อลบ ( NH4 ) 2so4 ก่อนโหลดไปยังคอลัมน์แลกเปลี่ยนแอนไอออน ( 2.5 × 20 ซม. ) ก่อน equilibrated DEAE cellulose บัฟเฟอร์ nh4hco3 10 มม. ( pH 7.5 ) คอลัมน์เป็นตัวอย่างกับบัฟเฟอร์เดียวกัน หลังจากเอาของ unadsorbed ยอด ( ส่วน D1 ) ที่ประกอบด้วยกิจกรรมเอนไซม์โปรตีเอสแข็งแรง สองพีค D2 และ D3 ดูดซับเศษส่วนเป็นตัวอย่างกับ 100 มม. และ 1 โมลาร์ ตามลำดับ ในการเริ่มต้นบัฟเฟอร์ ส่วนการใช้งาน ( D1 ) คือต่อไปภายใต้การแลกเปลี่ยนไอออนบวกคอลัมน์ ( 1.0 × 15 ซม. ) ของ SP - เกี่ยวข้องก่อน equilibrated 10 มิลลิเมตร กรดมะนาว บัฟเฟอร์ pH 5.0 ) หลังจากเอาของ unadsorbed โปรตีน ( ส่วน SP1 ) , คอลัมน์ตัวอย่าง ด้วยการไล่ระดับสีความเข้มข้นเชิงเส้น 0 – 800 mM NaCl 10 มิลลิเมตร กรดมะนาว บัฟเฟอร์ pH 5.0 ) เพื่อให้ได้ปริมาณการดูดซับโปรตีน ( เศษส่วน SP2 และ SP3 ) ส่วนการใช้งาน ( SP3 ) กับกิจกรรมเอนไซม์โปรตีเอสและบริสุทธิ์ใน superdex 75 ชั่วโมง 10 / 30 คอลัมน์ 0.15 เมตร nh4hco3 บัฟเฟอร์ pH 8.5 ) โดยโปรตีนวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวอย่างรวดเร็ว ( fplc ) ใช้ purifier เป็น akta ( GE Healthcare ) ส่วนแรก ( su1 ) ที่มีอยู่และโปรติเอส