Design of experiment (DoE) is a sta

Design of experiment (DoE) is a statistics-based technique for experimental design that could overcome the shortcomings of traditional one-factor-at-a-time (OFAT) approach for protein purification optimization. In this study, a DoE approach was applied for optimizing purification of a recombinant single-chain variable fragment (scFv) against type 1 insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) expressed in Escherichia coli. In first capture step using Capto L, a 2-level fractional factorial analysis and successively a central composite circumscribed (CCC) design were used to identify the optimal elution conditions. Two main effects, pH and trehalose, were identified, and high recovery (above 95%) and low aggregates ratio (below 10%) were achieved at the pH range from 2.9 to 3.0 with 32–35% (w/v) trehalose added. In the second step using cation exchange chromatography, an initial screening of media and elution pH and a following CCC design were performed, whereby the optimal selectivity of the scFv was obtained on Capto S at pH near 6.0, and the optimal conditions for fulfilling high DBC and purity were identified as pH range of 5.9–6.1 and loading conductivity range of 5–12.5 mS/cm. Upon a further gel filtration, the final purified scFv with a purity of 98% was obtained. Finally, the optimized conditions were verified by a 20-fold scale-up experiment. The purities and yields of intermediate and final products all fell within the regions predicted by DoE approach, suggesting the robustness of the optimized conditions. We proposed that the DoE approach described here is also applicable in production of other recombinant antibody constructs.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ออกแบบการทดลอง (DoE) เป็นเทคนิคที่ใช้สถิติสำหรับการออกแบบการทดลองที่สามารถเอาชนะข้อบกพร่องของวิธีการ (OFAT) หนึ่งปัจจัยเวลาเวลาดั้งเดิมสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน ในการศึกษานี้ DoE ที่วิธีใช้สำหรับเพิ่มประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant โซ่เดียวแปรส่วน (scFv) กับพิมพ์ 1 ปัจจัยการเจริญเติบโตคล้ายอินซูลินรีเซพเตอร์ (IGF-1R) แสดงใน Escherichia coli ในการจับภาพขั้นตอนแรกใช้ Capto L การ 2 ระดับเศษแฟกทอเรียลและติด ๆ กันกลางรวมอยู่ใน (CCC) ออกแบบถูกใช้ในการระบุเงื่อนไขที่เหมาะสมชะ ผลหลักสอง pH และ trehalose ระบุ และการกู้คืนสูง (มากกว่า 95%) และอัตราส่วนผลรวมต่ำ (ต่ำกว่า 10%) บรรลุผลที่อยู่ในช่วงค่า pH จาก 2.9 3.0 ด้วย trehalose 32 – 35% (w/v) เพิ่ม ในขั้นตอนสองใช้ chromatography แลกเปลี่ยน การคัดกรองเบื้องต้นสื่อและชะค่า pH และ CCC แบบต่อไปนี้ดำเนินการ โดยวิธีที่ดีที่สุดของ scFv ได้รับบน Capto S ที่ pH ใกล้ 6.0 และมีระบุเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับการ DBC และความบริสุทธิ์สูงเป็นช่วง pH 5.9 – 6.1 และโหลดช่วงค่าการนำไฟฟ้าของ mS 5 – 12.5 ซ.ม. เมื่อเครื่องกรองเจเพิ่มเติม scFv บริสุทธิ์สุดท้าย มีความบริสุทธิ์ 98% ได้รับ ในที่สุด มีเงื่อนไขเหมาะสมที่สุดถูกตรวจสอบ โดยการทดลองขนาดยี่สิบเท่า Purities และอัตราผลตอบแทนของผลิตภัณฑ์ระดับกลาง และขั้นสุดท้ายทั้งหมดตกอยู่ภายในภูมิภาคที่ทำนาย โดยวิธี DoE บอกเสถียรภาพของเงื่อนไขเหมาะสม เราเสนอว่า วิธี DoE ที่อธิบายไว้ที่นี่จะสามารถใช้ได้ในการผลิตโครงสร้างแอนติบอดี recombinant อื่น ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การออกแบบการทดลอง (กวาง) เป็นเทคนิคที่สถิติที่ใช้สำหรับการออกแบบการทดลองที่สามารถเอาชนะข้อบกพร่องของหนึ่งในปัจจัยที่เวลา (OFAT) วิธีการแบบดั้งเดิมสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพโปรตีนบริสุทธิ์ ในการศึกษานี้เป็นวิธีการที่ DoE ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant เดียวโซ่ชิ้นส่วนตัวแปร (scFv) กับชนิดที่ 1 อินซูลินเช่นปัจจัยการเจริญเติบโตรับ (IGF-1R) แสดงใน Escherichia coli ในขั้นตอนการจับครั้งแรกที่ใช้ Capto L การวิเคราะห์ปัจจัยเศษส่วน 2 ระดับและต่อเนื่องคอมโพสิตกลาง circumscribed (CCC) การออกแบบถูกนำมาใช้ในการระบุเงื่อนไขการชะที่ดีที่สุด สองลักษณะหลักของพีเอชและทรีฮาโล, มีการระบุและการกู้คืนสูง (กว่า 95%) และอัตราส่วนมวลต่ำ (ต่ำกว่า 10%) กำลังประสบความสำเร็จในช่วงที่ค่า pH 2.9-3.0 กับ 32-35% (w / v) ทรีฮาโลเพิ่ม . ในขั้นตอนที่สองใช้ไอออนโครมาแลกเปลี่ยนการคัดกรองเบื้องต้นของสื่อและการชะพีเอชและการออกแบบที่ CCC ต่อไปนี้ได้ดำเนินการโดยการเลือกที่ดีที่สุดของ scFv ที่ได้รับใน Capto S ที่ pH อยู่ใกล้กับ 6.0 และเงื่อนไขที่ดีที่สุดเพื่อตอบสนองความ DBC สูง และความบริสุทธิ์ถูกระบุว่าเป็นช่วงพีเอช 5.9-6.1 และช่วงโหลดการนำของ 5-12.5 mS / ซม. เมื่อกรองเจลต่อไปสุดท้ายบริสุทธิ์ scFv ที่มีความบริสุทธิ์ 98% ได้รับ ในที่สุดก็มีเงื่อนไขที่ดีที่สุดได้รับการตรวจสอบโดยการทดสอบระดับขึ้น 20 เท่า purities และอัตราผลตอบแทนของผลิตภัณฑ์ขั้นกลางและขั้นสุดท้ายทั้งหมดตกอยู่ในภูมิภาคที่คาดการณ์โดยวิธีโดบอกความทนทานของเงื่อนไขที่ดีที่สุดที่ เราเสนอว่าวิธีการ DoE อธิบายไว้ที่นี่ยังใช้ในการผลิตอื่น ๆ ที่สร้างแอนติบอดี recombinant