The plasmid template for production

The plasmid template for production of dsRNA was constructed in the stem-loop
structure for in vivo bacterial expression system. PAZ-dsRNA and PIWI-dsRNA were designed from
the coding sequence of the PAZ domain (396 bp) and 81 bp present only in the PIWI domain of
PemAGO-L, respectively. Two pairs of primers were used for the production of templates to
construct each dsRNA. The first PCR product contains stem and loop region (called sense strand).
The second PCR product contains only the stem that is identical to the stem region of the first PCR
product but inserted in an inverted orientation (called anti-sense strand) into pET-17b vector. The
recombinant plasmids (figure 1) were transformed into Escherichia coli HT115 strain bacterial
host that lacks RNase III activity. The dsRNAs were produced in bacterial system by IPTG
induction. The single-stranded RNA (ssRNA) in the loop region and endogenous RNA were
removed by RNase A treatment after bacterial cells lysis. The dsRNAs were then purified by TRIReagent
® and dissolved in 150 mM NaCl. The concentration of dsRNA was determined by agarose
gel electrophoresis. The dsRNAs were verified by digestion with RNase A and RNase III.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ต้นแบบสำหรับผลิต dsRNA plasmid ถูกสร้างในวงก้านโครงสร้างระบบแบคทีเรียนิพจน์ในสัตว์ทดลอง PAZ dsRNA และ PIWI dsRNA ถูกออกแบบมาจากลำดับที่รหัสโดเมน PAZ (396 bp) และ 81 อยู่ในโดเมน PIWI ของ bpPemAGO L ตามลำดับ สองคู่ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการผลิตการสร้างแต่ละ dsRNA ผลิตภัณฑ์ PCR แรกประกอบด้วยก้านและวนรอบภูมิภาค (เรียกว่าสาระของความรู้สึก)ผลิตภัณฑ์ PCR ที่สองประกอบด้วยก้านซึ่งจะเหมือนกับภาคต้นกำเนิดของ PCR ครั้งแรกผลิตภัณฑ์แต่แทรกในการกลับทิศ (เรียกว่าความรู้สึกต่อต้านสแตรนด์) เป็นสัตว์เลี้ยง-17b เวกเตอร์ ที่recombinant plasmids (รูป 1) ถูกเปลี่ยนเป็นแบคทีเรีย Escherichia coli HT115 ต้องใช้โฮสต์ที่ขาดกิจกรรม RNase III DsRNAs การผลิตในระบบแบคทีเรีย ด้วย IPTGเหนี่ยวนำ ควั่นเดียวอาร์เอ็นเอ (ssRNA) ในภูมิภาควนและอาร์เอ็นเอ endogenousเอา โดย RNase รักษาหลัง lysis เซลล์แบคทีเรีย DsRNAs ไม่บริสุทธิ์แล้ว โดย TRIReagent® และละลายใน 150 mM NaCl กำหนดความเข้มข้นของ dsRNA โดย agaroseเจ electrophoresis DsRNAs ถูกตรวจสอบ โดยย่อยอาหารกับ RNase A และ RNase III

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แม่แบบพลาสมิดสำหรับการผลิต dsRNA ก่อสร้างในก้านห่วง
โครงสร้างสำหรับระบบการแสดงออกทางร่างกาย ลาปาซ dsRNA piwi dsRNA และถูกออกแบบจากลำดับของลาปาซ
รหัสโดเมน ( 396 bp ) และ 81 BP ปัจจุบันเฉพาะใน piwi โดเมนของ
pemago-l ตามลำดับ สองคู่ของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการผลิตของแม่แบบ
สร้างแต่ละ dsRNA .ผลิตภัณฑ์ PCR ครั้งแรกมีต้นและภูมิภาค ( เรียกว่าความรู้สึกห่วงเกลียว ) .
ผลิตภัณฑ์ PCR ที่สอง มีเพียงลำต้นที่เป็นเหมือนภาคต้นของผลิตภัณฑ์ PCR
ตอนแรก แต่แทรกอยู่ในตัว ( เรียกว่าเส้นการต่อต้านความรู้สึก ) เป็นเวกเตอร์ pet-17b .
พลาสมิดพาหะ ( รูปที่ 1 ) ถูกเปลี่ยนเข้าสู่แบคทีเรีย Escherichia coli ht115
โฮสต์ที่ขาดเลส 3 กิจกรรม การ dsrnas ถูกผลิตในระบบแบคทีเรียโดยการเหนี่ยวนำเอนไซม์

เดี่ยว stranded RNA ( ssrna ) ในการวนรอบภูมิภาคและโครงสร้าง RNA ถูก
ลบออกโดยเลสรักษาหลังการสลายเซลล์แบคทีเรีย . การ dsrnas แล้วทำให้บริสุทธิ์ โดย trireagent
®และละลายในขนาด 150 มม. ความเข้มข้นของ dsRNA ถูกกำหนดโดย (
เจลที่ถูกตรวจสอบโดยการย่อยด้วย dsrnas เลสและเลส III