3. Results3.1. Isolation of cDNAs f

3. Results
3.1. Isolation of cDNAs for phenylpropanoid
pathway genes
Chile cDNA forms of Pal, Ca4h and Comt were
isolated from the haban˜ero cDNA library using
heterologous cDNA clones from alfalfa and soybean
[12,17,22]. DNA sequences from each of the
chile clones were determined and BLAST searches
were then conducted. In some cases the library
was re-screened to obtain longer forms of the
genes. Alignments were made of the sequences
obtained from the chile cDNA clones to cDNA
and genomic sequences of other plant genes. Based
on these alignments the clones were named Pal,
Ca4h or Comt.
3.1.1. Pal
The largest chile cDNA sequence for Pal was
1.8 kb, with a 1599 nucleotide ORF encoding 532
amino acids and a 256 nucleotide 3%UTR
(AF081215). The chile ORF had greater than 90%
amino acid sequence identity to Pal genes from
potato, tobacco and tomato (M84466; M83314;
X63103 [13]; M90692 [14]; D17467 [15]; X78269
[16]). Based on these alignments and sequence
analysis, the chile clone is not full-length, the
haban˜ero cDNA clone for Pal is missing all of the
5%UTR and approximately 549 bp corresponding
to the first 183 amino acids. The entire cDNA
sequence was used as a probe in the subsequent
genomic Southern analyses and RNA
hybridizations.
3.1.2. Ca4h
The largest chile cDNA clone for Ca4h had a
1.8 kb insert, with a 1410 nucleotide ORF encoding
469 amino acids, followed by a 236 nucleotide
3%UTR (AF088847). The chile ORF had a greater
than 88% amino acid sequence identity to Ca4h
genes from Catharanthus, Populus, Glycyrrhiza,
and Glycine (Z32563 [18]; D82815 [19]; D87520
[20]; X92437 [21]). Based on these alignments and
sequence analysis, the chile clone is not full-length,
the haban˜ero cDNA clone for Ca4h is missing all
of the 5%UTR and approximately 108 bp corresponding
to the first 36 amino acids. The entire
cDNA sequence was used as a probe in the subsequent
genomic Southern analyses and RNA
hybridizations.
3.1.3. Comt
The chile cDNA clone for Comt had a 1.4 kb
insert, corresponding to a full-length transcript
(AF081214, [31]). The chile ORF had 85% amino
acid sequence identity to Comt genes from C.
annuum or tobacco (U83789 [24]; X74452, X74453
[23]). The entire cDNA sequence was used as a
probe in the subsequent genomic Southern analyses
and RNA hybridizations.
3.2. Small gene families in chile encode Pal,
Ca4h, and Comt
Genomic Southern blots containing DNA from
three chile lines, two different types of pungent C.
chinense haban˜ ero, PI 1720 (pendant fruit) and PI
1678 (erect fruit), and a non-pungent mutant C.
chinense, PI 1721 were probed with each of the
three chile cDNA clones. All three cDNA probes
detected multiple fragments in the genomic digests
of all chile lines (Fig. 2). The cDNA sequences for
these genes have internal HindIII sites, one in Pal,
one in Comt and four in Ca4h. Some of the
genomic fragments must represent internal
HindIII sites within the gene sequences, and some
of the fragments represent multiple copies of each
gene in the genome. Based on the complexity of
the hybridization pattern, we predict that Pal,
Ca4h, and Comt are each comprised of small gene
families. While there were polymorphic bands that distinguished each C. chinense line for each gene
probe, the hybridization pattern for each gene
probe was similar in the three chile lines.
3.3. Transcript accumulations of Pal, Ca4h, and
Comt in placental tissue
Transcript accumulations of Pal, Ca4h, and
Comt were compared in RNA samples isolated
from placental tissue in haban˜ero fruit at three
different maturity stages. Northern blots demonstrated
that generally, transcript levels declined
during fruit development (Fig. 3). This developmental
trend was the most pronounced for Ca4h
and Comt transcripts. The same trend in transcript
accumulation was observed in placental samples at
three different maturity stages from a mild chile
type C. annuum c.v. NuMex 6-4 (data not shown).
Total capsaicinoid levels had been determined
on a subset of the fruit used for the RNA isolation
shown in Fig. 3. Dried fruit were ground and
extracted with acetonitrile and the total capsaicinoid content was determined by HPLC. Haban
˜ero fruit at green, green:orange and orange
stages had 115, 154 and 161 mg capsaicinoid:g dry
weight fruit respectively. Transcript levels for Pa1,
Ca4h, and Comt were maximal in placental tissues
prior to the maximal accumulation of the
capsaicinoids.
Placental transcript accumulations of Pal, Ca4h,
and Comt in immature fruit were compared in
RNA samples isolated from haban˜ ero, NuMex
6-4, and NuMex Conquistador (Fig. 3). Transcript
levels for Pal, Ca4h, and Comt were highest in
haban˜ ero, intermediate in NuMex 6-4 and lowest
in NuMex Conquistador. Of these chiles, haban
˜ero accumulates the highest levels of capsaicinoids
and is the most pungent, NuMex 6-4 is
mild, and NuMex Conquistador is a non-pungent
chile with the same fruit pod shape and size as
NuMex 6-4. Again, the most striking reduction in
transcript accumulation is observed for Ca4h and
Comt.
3.4. Pal, Ca4h, and Comt expression in fruit wall,
placenta, and seed: effect of fruit pungency
Transcript accumulations for Pal, Ca4h, and
Comt were determined in four different chile fruit
types: haban˜ ero, jalapen˜o, NuMex Joe E. Parker,
and CalWonder. The pungency levels for these
four chiles are listed in Table 1. This larger collection
of chile fruit types, representing different pod
shapes, was assayed to test the correlation between
placental transcript accumulations of phenylpropanoid
genes and fruit pungency levels. Transcript
levels were compared at two different stages
in fruit development, immature and mature, and
in three different tissues: fruit wall, placenta, and
seed. Transcript levels were normalized for RNA
load and expressed as relative intensities (Fig. 4).
In general, transcript levels for Pal, Ca4h, and
Comt were barely detectable in mature fruit relative
to immature fruit. This was observed in all
four chile types and in all three fruit tissues: fruit
wall, placenta, and seed (Fig. 4). Little to no
relationship between fruit pungency and transcript
level could be observed in samples from mature
fruit.
In immature fruit tissues, several trends in Pal,
Ca4h, and Comt expression were identified (Fig.
4). (1) For Pal and Ca4h, within a chile genotype,
transcripts were most abundant in seeds, followed by placenta followed by fruit wall. This trend was
also true for Comt for the two mildest chiles, but
not for haban˜ero and jalapen˜o. Placental samples
had the highest transcript levels for Comt, for
these two hottest chiles. (2) Among chile genotypes,
and across fruit tissues, a sample from
haban˜ero had the highest transcript levels for Pal,
Ca4h, and Comt. For each gene, the maximal
relative intensity was in a haban˜ero tissue. For Pal
and Ca4h maximal accumulation was in haban˜ero
seed, for Comt maximal accumulation was in haban
˜ero placenta. (3) In placental samples from
immature fruit there was a correlation between
fruit pungency level and transcript abundance for
all three genes. Transcript levels for Pal, Ca4h,
and Comt were the highest in haban˜ ero, followed
by jalapen˜o, NuMex Joe E. Parker and then Cal
Wonder. The germplasm rank order, for transcript
abundance for each of the three genes in the
placenta, is the same rank order for capsaicinoid
accumulation in the placenta.
3.5. Differential screening of haban˜ero placental
library
The cDNA library of haban˜ero placental transcripts
was screened to identify transcripts that
were abundant in haban˜ero samples and undetectable
in non-pungent samples. These transcripts
are predicted to encode genes related to capsaicinoid
biosynthesis. To date, there were relatively
few cDNA clones identified, 10 unique clones,
as abundant in haban˜ero placental tissue and low
abundance in non-pungent placental tissue. Two
of these clones have been well characterized and
appear to encode genes for enzymes on the capsaicinoid
biosynthetic pathway. Analysis of the other
clones is underway.
3.5.1. Kas
This cDNA clone (AF085148, [32]) contains a
complete open reading frame, 488 amino acids.
The predicted translation product is 75% identical
and 88% similar to 3-keto-acyl-ACP synthases
from plants based on BLASTP analysis
(AF026148; L13242; U24177; M60410, [33]).
There is a plastid targeting sequence present in the
amino-terminus of the predicted translation
product, based on PSORT analysis. A Kas1 activity
is predicted to extend isobutyryl CoA to make
the branched chain fatty acid
3.5.2. pAmt a putati6e aminotransferase
This cDNA clone (AF085149, [34]) contains a
complete open reading frame, 459 amino acids.
The predicted translation product is 40% identical
and 60% similar to a bacterial class III pyridoxalphosphate-
dependent aminotransferase, (Q53196,
[35]). All seven conserved domains in class III
pyridoxal-phosphate-dependent aminotransferases
are present in the chile cDNA clone, based on a
BLOCKS analysis [29]. The conversion of vanillin
to vanillylamine on the capsaicinoid pathway
would require an aminotransferase activity (Fig.
1).
3.6. Expression of pungency-related cDNA clones
The differential pattern of expression predicted
for pAmt and Kas based on the screening of the
placental library was confirmed with northern
blots (Fig. 5). Transcripts for both pAmt and Kas
were very abundant in placental tissue early in
fruit development and dropped below detectable
limits as the fruit matured. Transcripts for both
pAmt and Kas were very abundant in haban˜ero
and jalapen˜o placental tissue, reduced in NuMex
6-4, and not detectable in non-pungent C. chinense
placental tissue. These patterns of expression were
very similar to those determined for Pal, Ca4h and
Comt.
Transcript accumulations for pAmt and Kas in
other organs of the haban˜ero chile plant were
measured (Fig. 6). Transcripts for pAmt and Kas
appear to be placental-specific. Significant levels of
transcripts were detected onl

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1 การแยกของ cDNAs สำหรับ phenylpropanoidยีนที่ทางเดินแบบ Pal, Ca4h และ Comt cDNA ชิลีได้แยกต่างหากจาก haban˜ero cDNA ไลบรารีโดยใช้heterologous cDNA โคลนจาก alfalfa และถั่วเหลือง[12,17,22] ลำดับดีเอ็นเอจากแต่ละชิลีโคลนถูกกำหนด และค้นหาระเบิดได้แล้วดำเนินการ ในบางกรณีในไลบรารีมีสกรีนลายใหม่เพื่อขอรับแบบฟอร์มอีกต่อไปของการยีน จัดแนวทำลำดับได้รับมาจากชิลี cDNA โคลน cDNAและ genomic ลำดับของยีนพืชอื่น ๆ ตามในการจัดแนวนี้ โคลนได้ชื่อ PalCa4h หรือ Comt3.1.1. palมีลำดับ cDNA ชิลีที่ใหญ่ที่สุดสำหรับ Pal1.8 kb กับ 1599 นิวคลีโอไทด์ ORF รหัส 532กรดอะมิโนและนิวคลีโอไทด์ 3% 256 UTR(AF081215) ชิลี ORF ได้มากกว่า 90%กรดอะมิโนลำดับฐาน Pal ยีนจากมันฝรั่ง ยาสูบ และมะเขือเทศ (M84466 M8331463103 X [13]; M90692 [14]; D17467 [15]; X 78269[16]) . ตามลำดับและจัดแนวเหล่านี้วิเคราะห์ โคลนชิลีไม่ ปราศจากการhaban˜ero โคลน cDNA สำหรับพาลหายทั้งหมด5% UTR และสอดคล้องกับ bp ประมาณ 549ให้กรดอะมิโนก่อน 183 CDNA ทั้งหมดลำดับถูกใช้เป็นโพรบในการต่อมาภาคใต้วิเคราะห์ genomic และอาร์เอ็นเอhybridizations3.1.2. Ca4hCDNA clone ที่ใหญ่ที่สุดของประเทศชิลีสำหรับ Ca4h มีการ1.8 kb แทรก ด้วยการ 1410 นิวคลีโอไทด์ ORF เข้ารหัสกรดอะมิโน 469 ตาม ด้วยนิวคลีโอไทด์ 2363% UTR (AF088847) ชิลี ORF มีมากขึ้นกว่า 88% กรดอะมิโนลำดับฐาน Ca4hยีนจากแพงพวย Populus สมุนไพรและ Glycine (Z32563 [18]; D82815 [19]; D87520[20]; X [21] 92437) ตามการจัดแนวเหล่านี้ และวิเคราะห์ โคลนชิลีไม่ ปราศจากขาดโคลน cDNA haban˜ero สำหรับ Ca4h ทั้งหมดของ 5% UTR และสอดคล้องกับ bp ประมาณ 108ให้กรดอะมิโนก่อน 36 ทั้งหมดมีใช้ลำดับ cDNA เป็นโพรบในการต่อมาภาคใต้วิเคราะห์ genomic และอาร์เอ็นเอhybridizationsเป็น 3.1.3 Comt1.4 kb มีโคลน cDNA ชิลีสำหรับ Comtแทรก ที่สอดคล้องกับเสียงบรรยายปราศจาก(AF081214, [31]) ชิลี ORF ได้ 85% อะมิโนลำดับกรดฐานยีน Comt จาก cannuum หรือยาสูบ (U83789 [24]; X 74452, X 74453[23]) ลำดับ cDNA ทั้งหมดถูกใช้เป็นโพรบในวิเคราะห์ภาคใต้ genomic ภายหลังและอาร์เอ็นเอ hybridizations3.2. ครอบครัวยีนเล็กในชิลีเข้า PalCa4h และ Comtกันบล็อท genomic ที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอจากภาคใต้บรรทัดชิลี สองชนิด C. หอมฉุนero haban˜ chinense, PI 1720 (จี้ผลไม้) และปี่1678 (ตรงผลไม้), และ C. mutant ไม่หอมฉุนchinense, PI 1721 ได้พิสูจน์ด้วยการสามประเทศชิลี cDNA โคลน ทั้งหมดสาม cDNA คลิปปากตะเข้ตรวจพบชิ้นส่วนหลายใน genomic digestsรายการทั้งหมดชิลี (Fig. 2) ลำดับ cDNA สำหรับยีนเหล่านี้มีไซต์ภายใน HindIII หนึ่งใน Palหนึ่งในสี่ใน Ca4h และ Comt บางบางส่วนของ genomic ต้องแสดงถึงภายในเว็บไซต์ HindIII ภายในลำดับยีน และบางของชิ้นส่วนแสดงหลายสำเนาของแต่ละยีนในกลุ่ม ขึ้นอยู่กับความซับซ้อนของรูปแบบการ hybridization เราทายว่า ที่ PalCa4h และ Comt จะแต่ละประกอบด้วยยีนขนาดเล็กครอบครัว ในขณะที่มี polymorphic วงที่โดดเด่นแต่ละบรรทัด C. chinense สำหรับแต่ละยีนโพรบ รูปแบบการ hybridization ในแต่ละยีนโพรบคล้ายในชิลีสามบรรทัด3.3. accumulations เสียงบรรยายของ Pal, Ca4h และComt ในเนื้อเยื่อรกลอกAccumulations เสียงบรรยายของ Pal, Ca4h และComt ถูกเปรียบเทียบในตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากจากเนื้อเยื่อรกลอกในผลไม้ haban˜ero ที่สามขั้นตอนครบกำหนดแตกต่างกัน ภาคเหนือกันบล็อทสาธิตซึ่งโดยทั่วไป การลดลงของระดับเสียงบรรยายในระหว่างการพัฒนาผลไม้ (Fig. 3) พัฒนานี้แนวโน้มการออกเสียงมากที่สุดสำหรับ Ca4hและใบแสดงผล Comt แนวโน้มเดียวกันในเสียงบรรยายสะสมได้สังเกตในรกลอกตัวอย่างที่สามขั้นตอนครบกำหนดแตกต่างจากชิลีอ่อนพิมพ์ C. annuum ต่อ c.v. บูต NuMex 6-4 (ข้อมูลไม่แสดง)มีการกำหนดระดับรวม capsaicinoidบนชุดย่อยของผลไม้ที่ใช้สำหรับแยกอาร์เอ็นเอแสดงใน Fig. 3 ผลไม้ตากแห้งพื้นดิน และสกัด ด้วย acetonitrile และ capsaicinoid รวม เนื้อหาถูกกำหนด โดย HPLC Haban˜ero ผลไม้ที่สีเขียว สีเขียว: สีส้ม และสีส้มขั้นตอนมี 115, 154 และ 161 มิลลิกรัม capsaicinoid:g แห้งน้ำหนักผลไม้ตามลำดับ ระดับเสียงบรรยาย Pa1Ca4h และ Comt ได้สูงสุดในเนื้อเยื่อรกลอกก่อนที่จะสะสมสูงสุดของการcapsaicinoidsAccumulations รกลอกเสียงบรรยายของ Pal, Ca4hและ Comt ในผลไม้ immature ถูกเปรียบเทียบในตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากจาก haban˜ ero, NuMex6-4 และ NuMex Conquistador (Fig. 3) เสียงบรรยายระดับ Pal, Ca4h และ Comt ได้สูงที่สุดในhaban˜ ero ต่ำสุด และระดับกลางใน NuMex 6-4ใน NuMex Conquistador ของเหล่านี้ chiles, haban˜ero สะสม capsaicinoids ในระดับสูงสุดและสุดหอมฉุน NuMex 6-4ไมลด์ NuMex Conquistador เป็นการไม่หอมฉุนชิลีเหมือนผลไม้ฝักรูปร่างและขนาดเป็นNuMex 6-4 อีกครั้ง การลดโดดเด่นที่สุดในรวบรวมเสียงบรรยายเป็นสังเกตสำหรับ Ca4h และComt3.4. pal, Ca4h และ Comt ผนังผลไม้รก และเมล็ด: ผลของผลไม้ pungencyAccumulations เสียงบรรยายสำหรับ Pal, Ca4h และComt ถูกกำหนดในสี่ประเทศชิลีต่าง ๆ ผลไม้ชนิด: ero haban˜, jalapen˜o, NuMex Joe E. คเกอร์และ CalWonder ระดับ pungency สำหรับเหล่านี้chiles สี่แสดงไว้ในตารางที่ 1 คอลเลกชันนี้มีขนาดใหญ่ชนิดผลไม้ประเทศชิลี แทนฝักแตกต่างกันรูปร่าง ถูก assayed เพื่อทดสอบความสัมพันธ์ระหว่างaccumulations รกลอกเสียงบรรยายของ phenylpropanoidยีนและระดับ pungency ผลไม้ เสียงบรรยายระดับมีการเปรียบเทียบในขั้นตอนที่แตกต่างกันสองในการพัฒนาผลไม้ immature และ ผู้ใหญ่ และในเนื้อเยื่อต่าง ๆ สาม: ผนังผลไม้ รก และเมล็ด ระดับเสียงบรรยายได้ตามปกติในอาร์เอ็นเอโหลด และแสดงเป็นการปลดปล่อยก๊าซสัมพัทธ์ (Fig. 4)ระดับทั่วไป เสียงบรรยายสำหรับ Pal, Ca4h และComt ถูกแทบไม่สามารถตรวจสอบได้ในผลไม้ญาติผู้ใหญ่การผลไม้ immature นี้ถูกพบในทั้งหมดชิลีสี่ชนิด และเนื้อเยื่อผลไม้สามทั้งหมด: ผลไม้ติดผนัง รก และเมล็ด (Fig. 4) ไม่น้อยไปความสัมพันธ์ระหว่างผลไม้ pungency และเสียงบรรยายระดับที่สามารถสังเกตในตัวอย่างจากผู้ใหญ่ผลไม้ในเนื้อเยื่อผลไม้ immature แนวโน้มหลายใน PalCa4h และ Comt ได้นิพจน์ (ฟิก4) . (1) สำหรับ Pal และ Ca4h ในลักษณะทางพันธุกรรมประเทศชิลีใบแสดงผลได้มากที่สุดในเมล็ด ตาม ด้วยตาม ด้วยผลไม้ผนังรก แนวโน้มนี้ได้จริงสำหรับ Comt ใน chiles mildest สอง แต่ไม่สำหรับ haban˜ero และ jalapen˜o รกลอกตัวอย่างมีเสียงบรรยายระดับสูงสุดสำหรับ Comtchiles เหล่านี้ร้อนแรงที่สุด 2 (2) ระหว่างชิลีศึกษาจีโนไทป์และเนื้อ เยื่อผลไม้ ตัวอย่างhaban˜ero มีเสียงบรรยายระดับสูงสุดสำหรับ PalCa4h และ Comt สำหรับแต่ละยีน สูงสุดมีความเข้มสัมพัทธ์ในเยื่อ haban˜ero สำหรับ Palและสะสมสูงสุด Ca4h ใน haban˜eroเมล็ด การสะสมสูงสุด Comt ถูกใน haban˜ero รก (3) ในรกลอกตัวอย่างจากผลไม้ที่มีความสัมพันธ์ระหว่าง immatureผลไม้ pungency ระดับและเสียงบรรยายมากมายสำหรับยีนที่สามทั้งหมด ระดับเสียงบรรยายสำหรับ Pal, Ca4hและ Comt ได้สูงสุดใน haban˜ ero ตามโดย jalapen˜o, NuMex Joe E. คเกอร์ แล้ว Calสงสัยว่า ลำดับอันดับ germplasm สำหรับเสียงบรรยายมากมายสำหรับแต่ละยีนสามในการรก มีลำดับอันดับเดียวสำหรับ capsaicinoidสะสมในรก3.5 haban˜ero รกลอกคัดแตกต่างไลบรารีห้องสมุด cDNA ของ haban˜ero รกลอกใบแสดงผลถูกฉายเพื่อระบุใบแสดงผลที่มีมากมายในตัวอย่าง haban˜ero และสามคในตัวอย่างหอมไม่ฉุนด้วย ใบแสดงผลเหล่านี้คาดว่า จะเข้ารหัสยีนที่เกี่ยวข้องกับ capsaicinoidสังเคราะห์ วันที่ มีค่อนข้างระบุน้อย cDNA โคลน โคลนเฉพาะ 10ที่อุดมด้วยเนื้อเยื่อรกลอก haban˜ero และต่ำความอุดมสมบูรณ์ในรกลอกเยื่อหอมไม่ฉุน สองของโคลนเหล่านี้ได้ถูกดีลักษณะ และจะ เข้ารหัสยีนสำหรับเอนไซม์ capsaicinoidทางเดิน biosynthetic วิเคราะห์อื่น ๆโคลนอยู่ในระหว่างดำเนินการ3.5.1. Kasประกอบด้วยโคลน cDNA นี้ (AF085148, [32]) เป็นเปิดอ่านทั้งหมดเฟรม กรดอะมิโนที่ 488ผลิตภัณฑ์คาดการณ์แปลเป็น 75% เหมือนกันและคล้ายกับ synthases 3-keto-acyl-ACP 88%จากพืชที่ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ BLASTP(AF026148 L13242 U24177 M60410, [33])มีพลาสติดที่เป้าหมายอยู่ในลำดับอะมิโนนัสแปลคาดการณ์ผลิตภัณฑ์ ตามการวิเคราะห์ PSORT กิจกรรม Kas1คาดว่า จะขยาย isobutyryl CoA เพื่อให้กรดไขมันห่วงโซ่แบบแยกสาขา3.5.2 ภาพ pAmt putati6e aminotransferaseประกอบด้วยโคลน cDNA นี้ (AF085149, [34]) เป็นเปิดอ่านทั้งหมดเฟรม กรดอะมิโนที่ 459ผลิตภัณฑ์คาดการณ์แปลเป็น 40% เหมือนกันและคล้ายกับแบคทีเรียคลา pyridoxalphosphate III - 60%ขึ้น aminotransferase, (Q53196[35]) ไว้ทั้งหมดเจ็ดอยู่โดเมนในระดับ IIIaminotransferases pyridoxal ฟอสเฟตขึ้นอยู่กับอยู่ในโคลน cDNA ชิลี ตามแบบบล็อกวิเคราะห์ [29] การแปลงของวานิลลินไป vanillylamine บนทางเดิน capsaicinoidจะต้องมีกิจกรรม aminotransferase (ฟิก1)3.6 การนิพจน์ของ cDNA ที่เกี่ยวข้องกับ pungency clonesรูปแบบส่วนของนิพจน์ที่คาดการณ์ไว้สำหรับ pAmt และ Kas ตามตรวจของรกลอกไลบรารีได้รับการยืนยันกับภาคเหนือกันบล็อท (Fig. 5) ใบแสดงผลการ pAmt และ Kasมีชุกชุมมากในเนื้อเยื่อรกลอกก่อนกำหนดในผลไม้พัฒนา และลดลงต่ำกว่าสามารถตรวจสอบได้จำกัดเป็นผลไม้ matured ใบแสดงผลทั้งpAmt และ Kas ชุกชุมมากใน haban˜eroและลดเนื้อเยื่อรกลอก jalapen˜o, NuMex6-4 และไม่สามารถตรวจสอบได้ในไม่หอมฉุน C. chinenseเนื้อเยื่อรกลอก รูปแบบของนิพจน์เหล่านี้ได้มีลักษณะคล้ายกับกำหนดสำหรับ Pal, Ca4h และComtเสียงบรรยาย accumulations pAmt และ Kas ในมีอวัยวะอื่น ๆ ของโรงงาน haban˜ero ประเทศชิลีวัด (Fig. 6) ใบแสดงผลการ pAmt Kasปรากฏ เป็นรกลอกเฉพาะ อย่างมีนัยสำคัญระดับใบแสดงผลถูกตรวจพบยว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผล
3.1 แยก cDNAs สำหรับ phenylpropanoid
ยีนทางเดินในรูปแบบของยีนชิลี Pal, Ca4h และ COMT ถูกแยกออกจากห้องสมุดcDNA haban~ero ใช้โคลนยีนheterologous จากหญ้าชนิตและถั่วเหลือง[12,17,22] ลำดับดีเอ็นเอจากแต่ละโคลนชิลีได้รับการพิจารณาและการค้นหาระเบิดได้ดำเนินการแล้ว ในบางกรณีห้องสมุดเป็นอีกครั้งที่การคัดเลือกจะได้รับรูปแบบอีกต่อไปของยีน การจัดแนวที่ทำจากลำดับที่ได้รับจากโคลนยีนชิลีจะ cDNA และลำดับจีโนมของยีนพืชอื่น ๆ จากในการจัดแนวโคลนเหล่านี้ถูกตั้งชื่อ Pal, Ca4h หรือ COMT. 3.1.1 Pal ลำดับยีนชิลีที่ใหญ่ที่สุดสำหรับ Pal เป็น1.8 กิโลมี 1599 เบื่อหน่าย ORF การเข้ารหัส 532 กรดอะมิโนและเบื่อหน่าย 256 3% UTR (AF081215) ชิลี ORF มีมากกว่า 90% ลำดับบัตรกรดอะมิโนที่จะ Pal ยีนจากมันฝรั่งยาสูบและมะเขือเทศ(M84466; M83314; X63103 [13]; M90692 [14]; D17467 [15]; X78269 [16]) ขึ้นอยู่กับการจัดแนวเหล่านี้และลำดับการวิเคราะห์โคลนชิลีไม่ยาวเต็มรูปแบบที่โคลนยีนhaban~ero สำหรับ Pal จะหายไปทั้งหมดของUTR 5% และประมาณ 549 bp ที่สอดคล้องกันกับครั้งแรก183 กรดอะมิโน ยีนทั้งลำดับถูกใช้เป็นการสอบสวนในภายหลังการวิเคราะห์จีโนมภาคใต้และRNA hybridizations. 3.1.2 Ca4h ชิลี cDNA โคลนที่ใหญ่ที่สุดสำหรับ Ca4h มีแทรก1.8 กิโลมี 1410 เบื่อหน่าย ORF การเข้ารหัส469 กรดอะมิโนตามด้วย 236 เบื่อหน่าย3% UTR (AF088847) ชิลี ORF มีมากขึ้นกว่า88% ลำดับบัตรกรดอะมิโนที่จะ Ca4h ยีนจาก Catharanthus, Populus, Glycyrrhiza, และ Glycine (Z32563 [18]; D82815 [19]; ​​D87520 [20]; X92437 [21]) ขึ้นอยู่กับการจัดแนวเหล่านี้และการวิเคราะห์ลำดับที่โคลนชิลีไม่เต็มความยาวโคลนยีนhaban~ero สำหรับ Ca4h จะหายไปทั้งหมดของUTR 5% และประมาณ 108 bp ที่สอดคล้องกันกับครั้งแรก36 กรดอะมิโน ทั้งลำดับยีนที่ใช้เป็นหัววัดในภายหลังการวิเคราะห์จีโนมภาคใต้และRNA hybridizations. 3.1.3 COMT โคลนยีนชิลีสำหรับ COMT มี 1.4 กิโลแทรกสอดคล้องกับหลักฐานยาวเต็มรูปแบบ(AF081214 [31]) ชิลี ORF มี 85% อะมิโนตัวตนลำดับกรดยีนCOMT จาก C. annuum หรือยาสูบ (U83789 [24]; X74452, X74453 [23]) ลำดับยีนทั้งหมดถูกนำมาใช้เป็นหัววัดในภาคใต้ต่อมาวิเคราะห์จีโนมและอาร์เอ็นเอhybridizations. 3.2 ยีนครอบครัวเล็ก ๆ ในชิลีเข้ารหัส Pal, Ca4h และ COMT blots จีโนมภาคใต้ที่มีดีเอ็นเอจากสามบรรทัดชิลีสองประเภทที่แตกต่างกันของฉุนC. chinense haban~ ปอง, PI 1720 (ผลไม้จี้) และ PI 1678 (ผลไม้ที่สร้าง) และ กลายพันธุ์ที่ไม่ฉุน C. chinense, PI 1721 ได้รับการตรวจสอบกันของสามโคลนยีนชิลี ทั้งสาม probes cDNA ตรวจพบชิ้นส่วนหลายแห่งในย่อยสลายจีโนมของสายชิลีทั้งหมด (รูปที่. 2) ลำดับยีนสำหรับยีนเหล่านี้มีเว็บไซต์ HindIII ภายในหนึ่งใน Pal, หนึ่งใน COMT และสี่ใน Ca4h บางส่วนของชิ้นส่วนจีโนมต้องแสดงภายในเว็บไซต์HindIII ภายในลำดับยีนและบางส่วนของชิ้นส่วนแทนหลายสำเนาของแต่ละยีนในจีโนม ขึ้นอยู่กับความซับซ้อนของรูปแบบการผสมข้ามพันธุ์ที่เราคาดการณ์ว่า Pal, Ca4h และ COMT แต่ละประกอบด้วยยีนขนาดเล็กครอบครัว ในขณะที่มีวงดนตรีที่ประสบความสำเร็จ polymorphic แต่ละบรรทัด chinense ซียีนแต่ละหัววัดรูปแบบไฮบริสำหรับยีนแต่ละสอบสวนเป็นที่คล้ายกันในสามบรรทัดชิลี. 3.3 สะสม Transcript ของ Pal, Ca4h และCOMT ในเนื้อเยื่อของรกสะสมTranscript ของ Pal, Ca4h และCOMT ถูกนำมาเปรียบเทียบในตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่แยกออกจากเนื้อเยื่อรกในผลไม้haban~ero ที่สามขั้นตอนที่แตกต่างกันครบกําหนด blots ภาคเหนือแสดงให้เห็นว่าโดยทั่วไประดับหลักฐานการปรับตัวลดลงในระหว่างการพัฒนาผลไม้(รูปที่. 3) การพัฒนานี้แนวโน้มเป็นที่เด่นชัดมากที่สุดสำหรับ Ca4h และจิตบำบัด COMT แนวโน้มเดียวกันในหลักฐานการสะสมพบว่าในกลุ่มตัวอย่างรกที่สามขั้นตอนครบกําหนดแตกต่างจากชิลีอ่อนชนิดC. annuum พันธุ์ NuMex 6-4 (ไม่ได้แสดงข้อมูล). ระดับ capsaicinoid ทั้งหมดได้รับการพิจารณาในส่วนหนึ่งของผลไม้ที่ใช้สำหรับการแยกอาร์เอ็นเอที่แสดงในรูป 3. ผลไม้แห้งมาบดและสกัดด้วยacetonitrile และเนื้อหา capsaicinoid รวมถูกกำหนดโดยวิธี HPLC Haban ผลไม้ที่ ~ero สีเขียว, สีเขียวส้มและสีส้มขั้นตอนมี115, 154 และ 161 มก. แคปไซ: กรัมแห้งผลไม้น้ำหนักตามลำดับ ระดับ Transcript สำหรับ PA1, Ca4h และ COMT ได้สูงสุดในเนื้อเยื่อรกก่อนที่จะมีการสะสมสูงสุดของcapsaicinoids. สะสมหลักฐานรกของ Pal, Ca4h, และ COMT ในผลไม้ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะถูกนำมาเปรียบเทียบในตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากhaban~ ปอง, NuMex 6 4 และ NuMex Conquistador (รูปที่. 3) Transcript ระดับสำหรับ Pal, Ca4h และ COMT เป็นที่สูงที่สุดในhaban~ ปองกลางใน NuMex 6-4 และต่ำสุดในNuMex Conquistador ของ Chiles เหล่านี้ haban ~ero สะสมในระดับสูงสุดของ capsaicinoids และเป็นฉุนมากที่สุด NuMex 6-4 เป็นอ่อนและNuMex Conquistador คือไม่ฉุนชิลีกับรูปร่างฝักผลไม้และขนาดเดียวกันเป็นNuMex 6-4 อีกครั้งที่การลดลงที่โดดเด่นที่สุดในการสะสมหลักฐานเป็นที่สังเกตสำหรับ Ca4h และ COMT. 3.4 Pal, Ca4h และการแสดงออกในผนัง COMT ผลไม้รกและเมล็ด: ผลกระทบจากความรุนแรงของผลไม้สะสม Transcript สำหรับ Pal, Ca4h และ COMT ได้รับการพิจารณาในสี่ของผลไม้ที่แตกต่างกันชิลีประเภทhaban~ ปอง, jalapen~o, NuMex โจอี ปาร์กเกอร์และCalWonder ระดับความรุนแรงเหล่านี้สี่ Chiles มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 คอลเลกชันขนาดใหญ่ของผลไม้ชนิดชิลีคิดเป็นฝักที่แตกต่างกันรูปร่างได้รับการวิเคราะห์เพื่อทดสอบความสัมพันธ์ระหว่างการสะสมหลักฐานรกของphenylpropanoid ยีนและระดับความรุนแรงของผลไม้ Transcript ระดับเปรียบเทียบที่สองขั้นตอนที่แตกต่างกันในการพัฒนาผลไม้ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะและเป็นผู้ใหญ่และในสามของเนื้อเยื่อที่แตกต่างกัน: ผนังไม้รกและเมล็ด ระดับ Transcript เป็นปกติ RNA โหลดและแสดงเป็นญาติเข้ม (รูปที่. 4). โดยทั่วไประดับหลักฐานสำหรับ Pal, Ca4h และCOMT แทบจะตรวจพบในผลไม้ญาติผู้ใหญ่ผลไม้ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ นี้ได้รับการตั้งข้อสังเกตในทุกสี่ประเภทชิลีและในทั้งสามเนื้อเยื่อผลไม้: ผลไม้ผนังรกและเมล็ดพันธุ์(. รูปที่ 4) น้อยถึงไม่มีความสัมพันธ์ระหว่างความรุนแรงและผลไม้หลักฐานระดับอาจจะมีการตั้งข้อสังเกตในตัวอย่างจากผู้ใหญ่ผลไม้. ในเนื้อเยื่อของผลไม้ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะแนวโน้มในหลาย Pal, Ca4h และการแสดงออกที่ถูกระบุ COMT (รูปที่. 4) (1) สำหรับเพื่อนและ Ca4h ภายในจีโนไทป์ชิลียีนที่มีความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดในเมล็ดตามด้วยรกตามด้วยผนังไม้ แนวโน้มนี้เป็นจริงสำหรับ COMT สำหรับสอง Chiles ภาพได้ชัดเจน แต่ไม่ได้สำหรับhaban~ero และ jalapen~o ตัวอย่างรกมีระดับสูงสุดหลักฐานสำหรับ COMT สำหรับทั้งสองChiles ที่ร้อนแรงที่สุด (2) ในบรรดายีนชิลีและทั่วเนื้อเยื่อผลไม้ตัวอย่างจากhaban~ero มีระดับสูงสุดหลักฐานสำหรับ Pal, Ca4h และ COMT สำหรับยีนแต่ละสูงสุดเข้มญาติอยู่ในเนื้อเยื่อ haban~ero สำหรับเพื่อนและ Ca4h สะสมสูงสุดอยู่ใน haban~ero เมล็ดสะสม COMT สูงสุดอยู่ใน haban รก ~ero (3) ในตัวอย่างรกจากผลไม้ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะมีความสัมพันธ์ระหว่างระดับความรุนแรงของผลไม้และความอุดมสมบูรณ์หลักฐานสำหรับทั้งสามยีน ระดับ Transcript สำหรับ Pal, Ca4h, และ COMT เป็นที่สูงที่สุดใน haban~ ปองตามโดยjalapen~o, NuMex โจอีปาร์กเกอร์แล้วแคลเดอร์ เชื้อพันธุกรรมลำดับสำหรับหลักฐานความอุดมสมบูรณ์สำหรับแต่ละสามยีนในรกเป็นลำดับเช่นเดียวกันสำหรับแคปไซสะสมในรก. 3.5 การตรวจคัดกรองที่แตกต่างกันของ haban~ero รกห้องสมุดห้องสมุดcDNA ของยีนที่รก haban~ero ได้รับการคัดเลือกในการระบุยีนที่ที่มีความอุดมสมบูรณ์ในตัวอย่าง haban~ero และตรวจสอบไม่พบในตัวอย่างที่ไม่ฉุน ใบรับรองผลการเรียนเหล่านี้ที่คาดว่าจะเข้ารหัสยีนที่เกี่ยวข้องกับการ capsaicinoid สังเคราะห์ ในวันที่มีค่อนข้างไม่กี่โคลนยีนระบุ 10 โคลนที่ไม่ซ้ำกันเป็นที่อุดมสมบูรณ์ในเนื้อเยื่อของรกhaban~ero และต่ำความอุดมสมบูรณ์ในเนื้อเยื่อของรกที่ไม่ฉุน สองของโคลนเหล่านี้มีลักษณะที่ดีและปรากฏการเข้ารหัสยีนเอนไซม์ในcapsaicinoid เดินชีวสังเคราะห์ การวิเคราะห์อื่น ๆโคลนเป็นชิ้น. 3.5.1 Kas โคลนยีนนี้ (AF085148 [32]) มีเปิดอ่านสมบูรณ์กรอบ488 กรดอะมิโน. ผลิตภัณฑ์แปลที่คาดการณ์ไว้คือ 75% เหมือนกันและ88% คล้ายกับ synthases 3-Keto-acyl-ACP จากพืชจากการวิเคราะห์ BLASTP ( AF026148; L13242; U24177. M60410, [33]) มีลำดับ plastid กำหนดเป้าหมายจะอยู่ในอะมิโนปลายทางของการแปลที่คาดการณ์ผลิตภัณฑ์บนพื้นฐานของการวิเคราะห์PSORT กิจกรรม Kas1 คาดว่าจะขยาย CoA isobutyryl ที่จะทำให้ห่วงโซ่กิ่งกรดไขมัน3.5.2 pAmt aminotransferase putati6e โคลนยีนนี้ (AF085149 [34]) มีเปิดอ่านสมบูรณ์กรอบ459 กรดอะมิโน. ผลิตภัณฑ์แปลที่คาดการณ์ไว้คือ 40% เหมือนกันและ60% คล้ายกับแบคทีเรียชั้นที่สาม pyridoxalphosphate- aminotransferase ขึ้นอยู่กับ (Q53196, [35]) ทั้งเจ็ดโดเมนอนุรักษ์ในระดับที่สามaminotransferases pyridoxal ฟอสเฟตขึ้นอยู่กับที่มีอยู่ในโคลนยีนชิลีอยู่บนพื้นฐานของการวิเคราะห์บล็อก[29] แปลงของวานิลเพื่อ vanillylamine บนทางเดิน capsaicinoid จะต้องมีกิจกรรม aminotransferase (รูปที่. 1). 3.6 การแสดงออกของยีนโคลนนิ่งความรุนแรงที่เกี่ยวข้องกับรูปแบบที่แตกต่างกันในการแสดงออกที่คาดการณ์สำหรับpAmt Kas และอยู่บนพื้นฐานของการตรวจคัดกรองของห้องสมุดรกได้รับการยืนยันกับทางตอนเหนือของblots (รูปที่. 5) Transcripts ทั้ง pAmt และ Kas มีชุกชุมมากในเนื้อเยื่อของรกในช่วงต้นของการพัฒนาและผลไม้ลดลงต่ำกว่าที่ตรวจพบข้อจำกัด ในขณะที่ผลไม้สุก Transcripts ทั้งpAmt และ Kas มีชุกชุมมากใน haban~ero และ jalapen~o เนื้อเยื่อรกลดลงใน NuMex 6-4 และไม่สามารถตรวจพบใน chinense ซีที่ไม่ฉุนเนื้อเยื่อรก รูปแบบของการแสดงออกเหล่านี้มีความคล้ายกันมากกับผู้ที่กำหนดสำหรับ Pal, Ca4h และ COMT. สะสม Transcript สำหรับ pAmt และ Kas ในอวัยวะอื่นๆ ของพืช haban~ero ชิลีที่ถูกวัด(รูปที่. 6) Transcripts สำหรับ pAmt และ Kas ปรากฏเป็นรกเฉพาะ ระดับที่สําคัญของใบแสดงผลการตรวจพบ ONL