ATPase activity was assayed at 25 °

ATPase activity was assayed at 25 °C using a PK/LDH linked system in which the hydrolysis of ATP was coupled to the oxidation of NADH (Furriel et al., 2000). The oxidation of NADH was monitored at 340 nm (ε340 nm,pH 7.5 = 6,200 mol− 1 L cm− 1) in a FEMTO 700 plus spectrophotometer equipped with thermostatted cell holders. Orthovanadate-insensitive ATPase activity corresponds to the ATPase activity estimated using 50 μmol L− 1 sodium orthovanadate, sufficient to inhibit all P-type ATPases present in the microsomal fractions obtained from crabs held at all salinity/time combinations. Standard assay conditions (1.0 mL final volume) were 50 mmol L− 1 Hepes buffer, pH 7.5, 0.28 mmol L− 1 NADH, 4.2 mmol L− 1 PEP, PK (60 U), LDH (230 U), 50 μmol L− 1 orthovanadate, 1 μg alamethicin/μg protein and 3 mmol L− 1 KCl (to ensure adequate PK activity). Bafilomycin-insensitive ATPase activity was estimated as above employing bafilomycin A1 at empirically established concentrations sufficient to completely inhibit the microsomal V-ATPase at all salinity/time combinations. The difference in activity measured with and without bafilomycin A1 represents the V-ATPase activity. The optimal ATP and Mg2+ concentrations used in the reaction media to estimate the orthovanadate-insensitive and bafilomycin-insensitive ATPase activities differed with each salinity/time combination, and also were established empirically. These concentrations are given in the legends to Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3. Controls without added enzyme were included in each experiment to quantify the non-enzymatic hydrolysis of substrate. One enzyme unit (U) was defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1.0 nmol of ATP per minute at 25 °C. Specific activities are expressed as U.mg protein− 1. Assays were performed on duplicate aliquots and each experiment was repeated using three different gill homogenates obtained from different crab groups held at each salinity/time combination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กิจกรรม ATPase ที่ assayed ที่ 25 ° C โดยใช้ระบบ PK/LDH ลิงค์ที่ไฮโตรไลซ์ของ ATP ถูกควบคู่การเกิดออกซิเดชันของ NADH (Furriel et al., 2000) ออกซิเดชันของ NADH ถูกตรวจสอบที่ 340 nm (ε340 nm, cm− 1 L mol− pH 7.5 = ละ 6200 1) ในเครื่อง 700 บวกเครื่องทดสอบกรดด่างพร้อมใส่เซลล์ thermostatted Orthovanadate ซ้อน ATPase กิจกรรมสอดคล้องกับกิจกรรม ATPase ประเมินใช้ 50 μmol L− 1 โซเดียม orthovanadate เพียงพอยับยั้ง ATPases ชนิด P ทั้งหมดอยู่ในเศษ microsomal ที่ได้รับจากปูบริเวณชุดเค็ม/เวลาทั้งหมด เงื่อนไขมาตรฐานวิเคราะห์ (1.0 mL ปริมาตรสุดท้าย) ถูกบัฟเฟอร์ L− 1 Hepes mmol 50, pH 7.5, mmol 0.28 L− 1 NADH, mmol 4.2 PEP 1 L−, PK (60 U), LDH (230 U), 50 orthovanadate μmol L− 1 โปรตีน alamethicin/μg μg 1 และ 3 mmol L− 1 KCl (เพื่อตรวจสอบกิจกรรม PK พอ) มีประเมินกิจกรรมข้างต้นใช้ bafilomycin A1 ที่ empirically ATPase Bafilomycin ซ้อนก่อตั้งความเข้มข้นเพียงพอที่จะยับยั้ง V-ATPase microsomal ที่ชุดเค็ม/เวลาทั้งหมดอย่างสมบูรณ์ ความแตกต่างในกิจกรรมวัดด้วย และไม่ มี bafilomycin A1 แสดงถึงกิจกรรม V ATPase ที่เหมาะสม ATP และ Mg2 + ความเข้มข้นใช้ในการประเมินกิจกรรม ATPase orthovanadate ซ้อน และ bafilomycin ซ้อนสื่อปฏิกิริยาแตกต่างแต่ละชุดเค็ม/เวลา และยัง ได้ก่อตั้ง empirically ความเข้มข้นนี้ได้ในตำนาน Fig. 1, Fig. 2 และ Fig. 3 ควบคุม โดยเอนไซม์เพิ่มได้รวมในแต่ละการทดลองวัดปริมาณไฮโตรไลซ์ไม่เอนไซม์ในระบบของพื้นผิว เอนไซม์หนึ่งหน่วย (U) ถูกกำหนดเป็นจำนวนเอนไซม์ที่ hydrolyzes nmol 1.0 ของ ATP ต่อนาทีที่ 25 องศาเซลเซียส กิจกรรมหนึ่ง ๆ จะแสดงเป็น U.mg protein− 1 Assays ดำเนินบน aliquots ซ้ำ และการทดลองแต่ละไม่ซ้ำใช้เหงือกที่แตกต่างกันสาม homogenates ได้รับจากกลุ่มปูต่าง ๆ ที่จัดขึ้นในแต่ละชุดเค็ม/เวลา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กิจกรรม ATPase ได้รับการวิเคราะห์ที่ 25 ° C โดยใช้ PK / LDH ระบบเชื่อมโยงที่ย่อยสลายของเอทีพีเป็นคู่ที่จะเกิดออกซิเดชันของ NADH (ที่ Furriel et al., 2000) ออกซิเดชันของ NADH ได้รับการตรวจสอบที่ 340 นาโนเมตร (ε340นาโนเมตรค่า pH 7.5 = 6,200 mol- 1 ลิตรซม 1) ใน Femto 700 บวก spectrophotometer พร้อมกับผู้ถือมือถือ thermostatted กิจกรรม ATPase Orthovanadate ตายสอดคล้องกับกิจกรรม ATPase ประมาณ 50 ไมโครโมลโดยใช้ L- 1 โซเดียม orthovanadate เพียงพอที่จะยับยั้งการทั้งหมด ATPases P-ประเภทอยู่ในเศษส่วนไมโครได้รับจากการจัดขึ้นที่ปูเค็ม / รวมกันอยู่ตลอดเวลา เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน (1.0 มิลลิลิตรปริมาณสุดท้าย) 50 มิลลิโมล L- 1 บัฟเฟอร์ HEPES ค่า pH 7.5 0.28 มิลลิโมล L- 1 NADH 4.2 มิลลิโมล L- 1 PEP, PK (60 U), LDH (230 U) 50 ไมโครโมล L - 1 orthovanadate 1 ไมโครกรัม alamethicin / ไมโครกรัมโปรตีนและ 3 มิลลิโมล L- 1 KCl (เพื่อให้แน่ใจว่ากิจกรรม PK เพียงพอ) กิจกรรม ATPase สาร bafilomycin ตายเป็นที่คาดกันไว้ข้างต้นการใช้สาร bafilomycin A1 ที่ระดับความเข้มข้นที่จัดตั้งขึ้นสังเกตุสมบูรณ์เพียงพอที่จะยับยั้งไมโคร V-ATPase ที่ระดับความเค็ม / รวมกันอยู่ตลอดเวลา ความแตกต่างในกิจกรรมการวัดที่มีและไม่มีสาร bafilomycin A1 แสดงให้เห็นถึงกิจกรรม V-ATPase เอทีพีที่ดีที่สุดและความเข้มข้นของ Mg2 + ที่ใช้ในสื่อการเกิดปฏิกิริยาในการประมาณ orthovanadate ตายและกิจกรรม ATPase สาร bafilomycin ตายแตกต่างกับความเค็มแต่ละ / ครั้งรวมกันและยังเป็นที่ยอมรับสังเกตุ ความเข้มข้นเหล่านี้จะได้รับในตำนานที่จะมะเดื่อ 1 รูป และรูปที่ 2 3. การควบคุมการทำงานของเอนไซม์เพิ่มโดยไม่ต้องถูกรวมอยู่ในการทดลองแต่ละปริมาณการย่อยของเอนไซม์ที่ไม่ใช่ของพื้นผิว หนึ่งหน่วยเอนไซม์ (U) ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ไฮโดรไลซ์ 1.0 นาโนโมลของเอทีพีต่อนาทีที่ 25 ° C กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงจะแสดงเป็น U.mg โปรตีน 1. ตรวจได้ดำเนินการใน aliquots ที่ซ้ำกันและการทดสอบแต่ละซ้ำใช้สาม homogenates เหงือกที่แตกต่างกันได้รับจากกลุ่มที่แตกต่างกันปูเค็มจัดขึ้นที่แต่ละคน / ครั้งรวมกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กิจกรรม ATPase ซีรั่มที่ 25 ° C ใช้ PK / ลีดาเฮเชื่อมโยงระบบในการย่อยสลายของ ATP ซึ่งเป็นคู่กับปฏิกิริยาออกซิเดชันของ NADH ( furriel et al . , 2000 ) ออกซิเดชันของ NADH ถูกตรวจสอบที่ 340 nm ( ε 340 nm , pH 7.5 = 6200 mol − 1 cm − 1 ) ในเฟมโต 700 บวกความพร้อม thermostatted ถือมือถือorthovanadate ตายด้าน ATPase กิจกรรมสอดคล้องกับผลของกิจกรรมประมาณ 50 μ mol − 1 ลิตรใช้โซเดียม orthovanadate เพียงพอที่จะยับยั้งทั้งหมด atpases พีอยู่ในไมโครโซมจากปูเศษส่วนได้จัดขึ้นที่ผสมน้ำ / เวลาทั้งหมด เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน ( 1.0 มิลลิลิตร ปริมาณ 50 mmol l สุดท้าย ) − 1 ฮีเปส บัฟเฟอร์ พีเอช 7.5 , 0.28 mmol l NADH − 1 , − 1 ให้กำลังใจ 4.2 mmol l ,PK ( 60 U ) , LDH ( 230 u ) , 50 μโมล L − 1 orthovanadate 1 μกรัม / กรัมโปรตีนลาเมตทิซินμ 3 มิลลิโมล L − 1 . ( เพื่อให้มั่นใจว่ากิจกรรม PK เพียงพอ ) bafilomycin ตายด้าน ATPase กิจกรรมประมาณข้างบน ใช้ bafilomycin A1 ที่ใช้ความเข้มข้นเพียงพอที่จะสมบูรณ์ขึ้น ยับยั้งการ v-atpase ผสมตับที่ความเค็ม / เวลาทั้งหมดความแตกต่างในกิจกรรมวัดที่มีและไม่มี bafilomycin A1 เป็น v-atpase กิจกรรม เอทีพีที่เหมาะสมและ mg2 ความเข้มข้นที่ใช้ในปฏิกิริยาสื่อประมาณ orthovanadate ตายด้านและ bafilomycin กิจกรรม ATPase ความรู้สึกแตกต่างกับแต่ละความเค็ม / เวลารวมกัน และยังได้ก่อตั้งขึ้นจากผล . ความเข้มข้นเหล่านี้จะได้รับในตำนานกับรูปที่ 1รูปที่ 2 และรูปที่ 3 การควบคุมโดยไม่ต้องเพิ่มเอนไซม์อยู่ในช่วงการทดลองแต่ละที่ไม่ใช่เอนไซม์ของพื้นผิว หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ ( U ) คือกำหนดปริมาณของเอนไซม์ที่ hydrolyzes 1.0 ? ATP ต่อนาทีที่ 25 องศา โดยเฉพาะ เป็นกิจกรรมที่แสดงเป็น u.mg โปรตีน− 1หรือจำนวนที่ซ้ำกันเฉยๆ และแต่ละทำการทดลองซ้ำโดยใช้ที่แตกต่างกันสามกิล homogenates ที่ได้จากกลุ่มที่แตกต่างกันในแต่ละระดับความเค็มจัดปู / เวลาการรวมกัน