(this can be as little as a single

(this can be as little as a single base)
of the integrated Campbelled in DNA remaining in the chromosome, such that compared to 35 the original host cell, the "Campbell out" cell contains one or more intentional changes in
the chromosome (for example, a single base substitution, multiple base substitutions,
insertion of a heterologous gene or DNA sequence, insertion of an additional copy or copies
of a homologous gene or a modified homologous gene, or insertion of a DNA sequence
ซึ่งประกอบรวมด้วย more than one of these aforementioned examples listed above). A "Campbell 40 out" cell is, ทททคือ, obtained by a counter-selection against a gene that is contained in a
portion (the portion that is desired to be jettisoned) of the "Campbelled in" DNA sequence,
for example the Bacillus subtilis sacB-gene, which is lethal when expressed in a cell that is
grown in the presence of about 5% to 10% sucrose. Either with or without a counter-


PF 75583
11
selection, a desired "Campbell out" cell can be obtained or identified by screening for the desired cell, using any screenable phenotype, such as, but not limited to, colony morphology, colony color, presence or absence of antibiotic resistance, presence or
absence of a given DNA sequence by polymerase chain reaction, presence or absence of 5 an auxotrophy, presence or absence of an enzyme, colony nucleic acid hybridization,
antibody screening, etc. The term "Campbell in" and "Campbell out" can also be used as
verbs in various tenses to refer to the method or process described above.

It is understood that the homologous รีคอมบิเนชัน events that leads to a "Campbell in" or 10 "Campbell out" can occur over a range of DNA bases within the homologous DNA
sequence, and since the homologous sequences will be identical to each other for อย่างน้อย
part of this range, it is not usually possible to specify exactly where the crossover event
occurred. In other words, it is not possible to specify precisely which sequence was
originally from the inserted DNA, and which was originally from the chromosomal DNA. 15 Moreover, the first homologous DNA sequence and the second homologous DNA sequence
are usually separated by a region of partial non-homology, and it is this region of non-
homology that remains deposited in a chromosome of the "Campbell out" cell.
ทททคือ, first and second homologous DNA sequence are อย่างน้อย about 200 base pairs 20 in length, and can be up to several thousand base pairs in length. However, the procedure
can be made to work with shorter or longer sequences. For example, a length for the first
and second homologous sequences can range from about 500 to 2000 bases, and the
obtaining of a "Campbell out" from a "Campbell in" is facilitated by arranging the first and
second homologous sequences to be approximately the same length, ทททคือ with a 25 difference of less than 200 base pairs and ทททที่สุดคือ with the shorter of the two being
อย่างน้อย 70% of the length of the longer in base pairs.
ในหนึ่งรุรุ the increase of the activity of alanine ดีไฮโดรจีเนส is achieved by an
increased expression and/or activation of the alaD-gene ทททคือ by means of the 30 "Campbell รีคอมบิเนชัน" as described above.
ในหนึ่งรุรุ the reduction of the expression and/or activity of lactate ดีไฮโดรจีเนส
is achieved by an inactivation of the /dhA-gene which encodes the lactate ดีไฮโดรจีเนส
EC 1.1.1.27 or EC 1.1.1.28, the reduction of the expression and/or activity of the ไพรูเวต 35 ฟอร์เมต ไลเอส is achieved by an inactivation of the pf/A-gene which encodes for an activator
of ไพรูเวต ฟอร์เมต ไลเอส EC 1.97.1.4 or the reduction of the expression and/or activity of
the ไพรูเวต ฟอร์เมต ไลเอส is achieved by an inactivation the pf/D-gene which encodes the
ไพรูเวต ฟอร์เมต ไลเอส EC 2.3.1.54 and/or the reduction of the expression and/or activity of
the phosphoenolไพรูเวต คาร์บอกซีlase is achieved by an inactivation of the pckA-gene 40 which encodes the phosphoenolไพรูเวต คาร์บอกซีlase EC 4.1.1.49.



PF 75583
12
ในหนึ่งรุรุ the inactivation of these genes (i. e. IdhA, pflA , pflD and/or pckA) is ทททคือ achieved by a deletion of theses genes or parts thereof, by a deletion of a regulatory element of these genes or อย่างน้อย a part thereof or by an introduction of อย่างน้อย
one deleterious mutation into these genes, โดยที่ these modifications are ทททคือ 5 performed by means of the "Campbell รีคอมบิเนชัน" as described above.

The IdhA-gene ทททคือ ประกอบรวมด้วย a nucleic acid selected from the group consisting of:

a) nucleic acids having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
10 b) nucleic acids encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
c) nucleic acids which are อย่างน้อย 80%, ทททคือ อย่างน้อย 90%, ทททกว่าคือ อย่างน้อย
95% and ทททที่สุดคือ อย่างน้อย 96%, ทททที่สุดคือ อย่างน้อย 97%, ทททที่สุดคือ at
least 98% ทททที่สุดคือ อย่างน้อย 99% identical to the nucleic acid of a) or b), the
identity being the ident

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(สามารถเป็นฐานเดียว) ของ Campbelled รวมในดีเอ็นเอที่เหลืออยู่ในโครโมโซม ให้เปรียบเทียบกับ 35 เซลล์โฮสต์เดิม เซลล์ "Campbell ออก" ประกอบด้วย น้อยมิเปลี่ยนแปลง โครโมโซม (เช่น การแทนฐานเดียว หลายพื้นฐานทดแทน แทรกของยีน heterologous หรือลำดับดีเอ็นเอ แทรกการสำเนาเพิ่มเติมหรือคัดลอก ของยีน homologous หรือยีน homologous แก้ไข แทรกลำดับดีเอ็นเอ ซึ่งประกอบรวมด้วยตัวอย่างดังกล่าวนี้มากกว่าหนึ่งข้าง) เป็นเซลล์ "Campbell 40 ออก" ทททคือ ได้รับ โดยเลือกเคาน์เตอร์กับยีนที่มีอยู่ในตัว ส่วน (ส่วนที่ต้องการเป็น jettisoned) ของลำดับดีเอ็นเอ "Campbelled ใน" ตัวอย่าง sacB subtilis คัดยีน ซึ่งเป็นยุทธภัณฑ์เมื่อแสดงในเซลล์ที่อยู่ เติบโตในต่อหน้าของประมาณ 5% ถึง 10% ซูโครส มีหรือไม่ มีตัวนับแบบ PF 7558311เลือก เซลล์ต้อง "Campbell ออก" สามารถรับ หรือระบุการคัดกรองเซลล์ต้อง ใช้ phenotype ใด ๆ screenable เช่น แต่ไม่จำกัดเฉพาะการ สัณฐานวิทยาของโคโล โคโลนีสี หรือต้านทานยาปฏิชีวนะ สถานะ หรือขาดของลำดับดีเอ็นเอกำหนดโดยพอลิเมอเรสโซ่ปฏิกิริยา หรือ 5 auxotrophy หรือมีเอนไซม์ อาณานิคมกรดนิวคลีอิก hybridization ตรวจแอนติบอดี ฯลฯ คำว่า "Campbell ใน" และ "Campbell ออก" ยังสามารถใช้เป็น คำกริยาในกาลต่าง ๆ เพื่ออ้างอิงถึงวิธีการหรือกระบวนการที่อธิบายไว้ข้างต้นมันคือเข้าใจว่า homologous รีคอมบิเนชันเหตุการณ์ที่นำไปสู่การ "Campbell ใน" หรือ 10 "Campbell ออก" สามารถเกิดขึ้นได้ช่วงฐานดีเอ็นเอภายในดีเอ็นเอ homologous ลำดับ และ ตั้งแต่ลำดับที่ homologous จะเหมือนกันสำหรับอย่างน้อย ส่วนช่วงนี้ มันเป็นมักจะระบุว่าที่เหตุการณ์แบบไขว้ เกิดขึ้น ในคำอื่น ๆ ไม่สามารถระบุชัดเจนเป็นลำดับที่ จากดีเอ็นเอแทรก กซึ่งเดิมจาก DNA ของโครโมโซมเดิม 15 Moreover ลำดับดีเอ็นเอ homologous แรก และลำดับที่สองของดีเอ็นเอ homologous มักจะแยกออกจากกัน โดยกำเนิดไม่ใช่บางส่วน-homology และมันเป็นของไม่ homology ที่ยังคงนำฝากในโครโมโซมของเซลล์ "Campbell ออก"ทททคือ และสองลำดับดีเอ็นเอ homologous มีอย่างน้อยเกี่ยวกับ 200 ฐานคู่ 20 ความยาว และจะได้คู่หลายพันฐานความยาว อย่างไรก็ตาม ขั้นตอน สามารถทำงานกับลำดับที่สั้น หรือยาว ตัวอย่าง ความยาวสำหรับครั้งแรก และลำดับที่สอง homologous สามารถช่วงจากประมาณ 500 2000 ฐาน และ ได้รับของเป็น "Campbell ออก" จากการ "Campbell ใน" จะอำนวยความสะดวก โดยจัดครั้งแรก และ สอง homologous ลำดับ ประมาณความยาว ทททคือ มีความแตกต่าง 25 คู่ฐานน้อยกว่า 200 และทททที่สุดคือกับที่สองสั้น อย่างน้อย 70% ของความยาวของอีกต่อไปในฐานคู่ในหนึ่งรุรุการเพิ่มขึ้นของกิจกรรมของดีไฮโดรจีเนสอะลานีนสามารถทำได้โดยการ เพิ่มนิพจน์หรือเรียกใช้การทททคือ alaD ยีนโดยใช้เวลา " Campbell รีคอมบิเนชัน" ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในหนึ่งรุรุลดของนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของ lactate ดีไฮโดรจีเนส สามารถทำได้ โดยการยกเลิกการเรียก /dhA-gene ซึ่งจแมป lactate ดีไฮโดรจีเนส EC 1.1.1.27 หรือ EC 1.1.1.28 การลดลงของนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของไลเอสฟอร์เมตไพรูเวต 35 สามารถทำได้ โดยการยกเลิกการเรียก pf/A-ยีนซึ่งจแมปสำหรับ activator เป็น ไพรูเวตฟอร์เมตไลเอส EC 1.97.1.4 หรือการลดลงของนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของ ไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสสามารถทำได้ โดยการยกเลิกการเรียก pf/D-ยีนซึ่งจแมป ไพรูเวตฟอร์เมตไลเอส EC 2.3.1.54 หรือการลดลงของนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของ phosphoenolไพรูเวต คาร์บอกซีlase สามารถทำได้ โดยการยกเลิกการเรียกการ pckA-ยีน 40 ซึ่งจแมป คาร์บอกซีlase phosphoenolไพรูเวต EC 4.1.1.49 PF 7558312ในหนึ่งรุรุยกเลิกการเรียกของยีนเหล่านี้ (i. e. IdhA, pflA, pflD หรือ pckA) จะทำได้ โดยการลบผลงานยีนหรือชิ้นส่วนดังกล่าว โดยการลบองค์ประกอบกฎระเบียบเหล่านี้ยีนหรืออย่างน้อยส่วนดังกล่าว หรือ โดยการแนะนำอย่างน้อยทททคือการกลายพันธุ์ร้ายหนึ่งเป็นยีนเหล่านี้ การปรับเปลี่ยนเหล่านี้เป็นทททคือ 5 ดำเนินการตามวิธีของโดยที่ " Campbell รีคอมบิเนชัน" ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นการยีน IdhA ทททคือประกอบรวมด้วยกรดนิวคลีอิกที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วย:ก) กรดนิวคลีอิกมีลำดับนิวคลีโอไทด์ของลำดับ ID ไม่: 510 b) กรดนิวคลีอิกเข้ารหัสกรดอะมิโนลำดับของลำดับ ID ไม่: 6c) กรดนิวคลีอิกซึ่งเป็นอย่างน้อย 80% ทททคืออย่างน้อย 90% ทททกว่าคืออย่างน้อย 95% และทททที่สุดคืออย่างน้อย 96% ทททที่สุดคืออย่างน้อย 97% ทททที่สุดคือที่ อย่างน้อย 98% ทททที่สุดคืออย่างน้อย 99% เหมือนกับกรดนิวคลีอิกของ) หรือ b), การ เอกลักษณ์การ ident

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(ซึ่งอาจจะเป็นเพียงฐานเดียว)
ของ Campbelled แบบบูรณาการใน DNA ที่เหลืออยู่ในโครโมโซมเช่นว่าเมื่อเทียบกับ 35 เซลล์โฮสต์เดิมที่ "แคมป์เบลจาก"
เซลล์มีหนึ่งหรือการเปลี่ยนแปลงเจตนาในโครโมโซม(ตัวอย่างเช่น ,
ทดแทนฐานเดียวแทนฐานหลายแทรกของยีนheterologous หรือลำดับดีเอ็นเอแทรกสำเนาเพิ่มเติมหรือสำเนาของยีนที่คล้ายคลึงกันหรือยีนที่คล้ายคลึงกันแก้ไขหรือการแทรกซึมของลำดับดีเอ็นเอซึ่งประกอบรวมด้วยมากกว่าหนึ่งเหล่านี้เป็นตัวอย่างดังกล่าวข้างต้นที่กล่าวข้างต้น) A "แคมป์เบล 40 ออก" มือถือ, ทททคือได้โดยเคาน์เตอร์เลือกกับยีนที่มีอยู่ในที่ส่วน(ส่วนที่เป็นที่ต้องการที่จะ jettisoned) ของ "Campbelled ใน" ลำดับดีเอ็นเอตัวอย่างเช่นเชื้อ Bacillus subtilis sacB ยีนซึ่งเป็นตายเมื่อแสดงในมือถือที่เป็นที่ปลูกในที่ที่มีประมาณ5% ถึง 10% น้ำตาลซูโครส ไม่ว่าจะมีหรือไม่มีเคาน์เตอร์PF 75583 11 เลือกที่ต้องการ "แคมป์เบลออก" มือถือสามารถรับได้หรือระบุการตรวจคัดกรองสำหรับเซลล์ที่ต้องการใช้ใด ๆ ฟีโนไทป์ screenable เช่น แต่ไม่ จำกัด เฉพาะสัณฐานวิทยาอาณานิคมสีอาณานิคม มีหรือไม่มีความต้านทานยาปฏิชีวนะการแสดงตนหรือขาดหายไปของลำดับดีเอ็นเอที่กำหนดโดยวิธีPolymerase chain reaction แสดงตนหรือไม่มี 5 auxotrophy แสดงตนหรือไม่มีเอนไซม์อาณานิคมพันธุ์กรดนิวคลีอิกคัดกรองแอนติบอดีฯลฯ คำว่า "แคมป์เบลใน "และ" แคมป์เบลออก "นอกจากนี้ยังสามารถนำมาใช้เป็นคำกริยาในกาลต่างๆเพื่อหมายถึงวิธีการหรือกระบวนการที่อธิบายข้างต้น. เป็นที่เข้าใจว่าคล้ายคลึงรีคอมบิเนชันเหตุการณ์ที่นำไปสู่การ" แคมป์เบลใน "หรือ 10" แคมป์เบลออกมา "สามารถเกิดขึ้นได้ในช่วงของฐานดีเอ็นเอภายในดีเอ็นเอคล้ายคลึงกันลำดับและตั้งแต่ลำดับคล้ายคลึงกันจะเหมือนกันสำหรับอย่างน้อยส่วนหนึ่งของช่วงนี้ก็ไม่ได้เป็นไปได้ที่จะมักจะระบุว่าที่ครอสโอเวอร์เหตุการณ์ที่เกิดขึ้น ในคำอื่น ๆ มันไม่ได้เป็นไปได้ที่จะระบุอย่างแม่นยำซึ่งลำดับเป็นพื้นเพมาจากดีเอ็นเอแทรกและที่มีพื้นเพมาจากดีเอ็นเอโครโมโซม 15 นอกจากนี้ยังมีลำดับดีเอ็นเอคล้ายคลึงกันครั้งแรกและลำดับดีเอ็นเอคล้ายคลึงกันที่สองจะถูกแยกออกโดยปกติพื้นที่ของบางส่วนที่ไม่คล้ายคลึงกันและมันก็เป็นพื้นที่ของที่ไม่ใช่นี้ที่คล้ายคลึงกันที่ยังคงสะสมอยู่ในโครโมโซมของเซลล์"แคมป์เบลออก". ท ททคือครั้งแรกและครั้งที่สองลำดับดีเอ็นเอที่มีความคล้ายคลึงกันอย่างน้อยประมาณ 200 ฐานคู่ที่ 20 ในความยาวและสามารถเป็นได้ถึงหลายพันฐานคู่ยาว อย่างไรก็ตามขั้นตอนสามารถทำได้ในการทำงานกับลำดับสั้นหรือยาว ตัวอย่างเช่นความยาวเป็นครั้งแรกลำดับคล้ายคลึงกันและครั้งที่สองได้ตั้งแต่ประมาณ 500-2,000 ฐานและได้รับของ"แคมป์เบล" ออกจาก "แคมป์เบลใน" จะอำนวยความสะดวกโดยการจัดครั้งแรกและลำดับที่คล้ายคลึงกันที่สองจะเป็นประมาณระยะเวลาเดียวกันทททคือมี 25 ความแตกต่างน้อยกว่า 200 คู่เบสและทททที่สุดคือมีสั้นของทั้งสองเป็นอย่างน้อย70% ของความยาวของอีกคู่ฐาน. ในหนึ่งรุรุเพิ่มขึ้นของกิจกรรม ของอะลานีนดีไฮโดรจีเนสจะประสบความสำเร็จโดยการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นและ/ หรือการเปิดใช้งานของ alaD ยีนทททคือโดยวิธีการของ 30 "แคมป์เบลรีคอมบิเนชัน" ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. ในหนึ่งรุรุลดลงของ การแสดงออกและ / หรือกิจกรรมของแลคเตทดีไฮโดรจีเนสจะประสบความสำเร็จโดยการใช้งานของ/ DHA ยีนที่เข้ารหัสให้น้ำนมดีไฮโดรจีเนสEC 1.1.1.27 หรือ EC 1.1.1.28 การลดลงของการแสดงออกและ / หรือกิจกรรมของไพรูเวต 35 ฟอร์เมตไลเอสจะทำได้โดยการใช้งานของ PF AN / A-ยีนซึ่ง encodes สำหรับกระตุ้นของไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสอีซี1.97.1.4 หรือการลดลงของการแสดงออกและ / หรือกิจกรรมของไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสจะทำได้โดยการใช้งานที่PF / D-ยีนที่เข้ารหัสไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสอีซี2.3 .1.54 และ / หรือการลดลงของการแสดงออกและ / หรือกิจกรรมของphosphoenol ไพรูเวตคาร์บอกซี Lase จะทำได้โดยการใช้งานของ pckA ยีน 40 ซึ่งเข้ารหัส phosphoenol ไพรูเวตคาร์บอกซี Lase EC 4.1 .1.49. PF 75583 12 ในหนึ่งรุรุพลังของยีนเหล่านี้ (เช่น IdhA, pflA, pflD และ / หรือ pckA) คือทททคือประสบความสำเร็จโดยการลบยีนวิทยานิพนธ์หรือชิ้นส่วนดังกล่าวโดยการลบองค์ประกอบการกำกับดูแลของเหล่านี้ ยีนหรืออย่างน้อยส่วนหนึ่งของมันหรือโดยการแนะนำของอย่างน้อยหนึ่งการกลายพันธุ์ของยีนเข้าสู่อันตรายเหล่านี้โดยที่การปรับเปลี่ยนเหล่านี้เป็นทททคือ5 ดำเนินการโดยวิธีการของ "แคมป์เบรีคอมบิเนชัน" ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. IdhA- ยีนทททคือประกอบรวมด้วยกรดนิวคลีอิกเลือกจากกลุ่มประกอบด้วยก) กรดนิวคลีอิกที่มีลำดับเบสของ SEQ ID NO: 5; 10 ข) กรดนิวคลีอิกเข้ารหัสลำดับกรดอะมิโนของ SEQ ID NO: 6; ค ) กรดนิวคลีอิกซึ่งมีอย่างน้อย 80%, ทททคืออย่างน้อย 90%, ทททกว่าคืออย่างน้อย95% และทททที่สุดคืออย่างน้อย 96%, ทททที่สุดคืออย่างน้อย 97%, ทททที่สุดคือที่อย่างน้อย 98% ทททที่สุดคืออย่างน้อย 99% เหมือนของกรดนิวคลี) หรือข) ที่ตัวตนเป็นident