- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Human aromatase (CYP19) converts C1
Human aromatase (CYP19) converts C19 androgens
to aromatic C18 estrogenic steroids (1) and also metabolizes
some xenobiotics (2). Inhibitors of this enzyme
are currently in use to treat postmenopausal breast
cancer and other estrogen-dependent diseases (3).
More recently, aromatase inhibitors have been identified as potential environmental toxins (so-called “endocrine disruptors”) (4). The standard method to detect
aromatase inhibitors specifies use of human placental
tissue as a source of aromatase enzyme and radiolabeled
C19 androgens as substrates (5). To eliminate
potential hazards of using human tissues or radiolabeled
materials, methods describing the use of recombinant
sources of enzyme (4, 6) and HPLC separation
with UV detection (7, 8) have been developed. However,
these methods may lack sensitivity, necessitate
use of cell culture, and are relatively laborious.
We have developed a semiautomated high-throughput
screening method utilizing recombinant human
aromatase and the fluorometric substrate O-benzylfluorescein
benzyl ester (DBF).2 The methodology is
similar to that developed previously for detecting drug
candidates with metabolism-based drug-drug interaction
potential (9). All components of the assay are
commercially available. When the assay is performed
manually, a fluorometric plate reader is the only required
instrumentation. Assays were conducted in 96-well microtiter plates
(Catalog No. 3915, Corning Costar, Cambridge, MA) in
a 200-ml volume. The substrate DBF was obtained from
Gentest Corporation (Woburn, MA). Furafylline, sulfaphenazole,
and ketoconazole were obtained from Ultrafine Chemicals limited (Manchester, UK). Quinidine,
tranylcypromine, testosterone, androstenedione, estradiol,
estrone, 4-OHA, AG, quercetin, (6)-naringenin,
chrysin, and ANF were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) and Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) were a kind gift of Dr. Willem Schoonen of N. V. Organon, the Netherlands. Aromatase enzyme (baculovirus/insect cell-expressed) was obtained from Gentest
Corporation. Characterization of the enzyme, including
steroidal aromatase activity and role in the
metabolism of xenobiotics, was as described (10). A
50% inhibitory concentration (IC50) was determined
utilizing 12 wells in each test. A cofactor/serial dilution
(C/SD) buffer was prepared in 50 mM potassium phosphate,
pH 7.4. This buffer contained 2.6 mM NADP1,
6.6 mM glucose 6-phosphate, 0.8 U/ml glucose-6-phosphate
dehydrogenase, and 0.1 mg/mL microsomal protein
prepared from insect cells infected with wild-type
virus (“control protein”). To the first well in each row,
150 ml of the test compound (dissolved in acetonitrile)
and C/SD buffer were added in a ratio of 6:144. In all
remaining wells, 100 ml of C/SD buffer containing 4%
acetonitrile was added. The final concentration of the
test substances in the first well was 0.1 to 100 mM.
Fifty microliters of the mixed solution from the first
well in each row was dispensed into the second well
and diluted serially 1:3 through the eighth well. Wells
9 and 10 contained no inhibitor and wells 11 and 12
were used as controls for background fluorescence (enzyme
and substrate were added after the reaction was
terminated). Addition of the test compounds and C/SD
buffer and serial dilutions were performed using a
Multiprobe II liquid handling station (Packard Instruments,
Downers Grove, IL). The plate was then preincubated
at 37°C for 10 min, and the reaction initiated
by the addition of 100 ml of prewarmed enzyme/substrate
(E/S) mix. The E/S mix contained buffer, cDNAexpressed
P450 (4 pmol/mL, 2 pmol/mL final), control
protein (0.4 mg/mL, 0.25 mg/mL final), substrate (0.4
mM, 0.2 mM final), and 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4. The final concentration of DBF was chosen to be approximately the K m (Table 1). Fluorescein
metabolite production was linear with time and
enzyme concentration up to 30 min and 2 pmol/mL,
respectively, and these parameters were used to determine
IC50 values. Reactions were terminated by addition
of 75 ml 2 N NaOH. To develop adequate signal to
background ratio, the plate (with lid) was then incubated for 2 h at 37°C. Fluorescence per well was measured
in top-read mode using a FLUOstar Model 403
fluorescence plate reader (BMG LabTechnologies, Inc.,
Durham, NC). Metabolite concentration was measured
using an excitation wavelength of 485 nm and an emission
wavelength of 538 nm. Data were exported and
analyzed using an Excel spreadsheet and the IC50 values
calculated by linear interpolation.
Several compounds were selected to evaluate the
assay (Table 2) and the results compared to those
found in the literature (Table 3). As shown, the assay
successfully detected the steroidal, mechanism-based
aromatase inhibitor 4-OHA (11) and the nonsteroidal
inhibitor AG in the predicted rank order. The androstenedione
analogs, Org 30365 and Org 30958, were
the most potent of all compounds examined (12). The
IC50 values found for the endogenous substrates testosterone
and androstenedione are consistent with reported
K m values of 10–80 nM (13–15). Estradiol and
estrone, the products of testosterone and androstenedione
metabolism, respectively, were found to be relatively
weak inhibitors, as expected. The flavonoid compounds
ANF, chrysin, naringenin, and quercetin were
examined based on their reported activity as aromatase
inhibitors (14). The rank order and potency
were comparable to those found previously. The assay
was also able to detect broad-spectrum cytochrome
P450 inhibitors such as the antifungal agent ketoconazole
and the monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine.
By contrast, quinidine, sulfaphenazole, and
furafylline, selective inhibitors of the drug-metabolizing
cytochrome P450 isoforms, CYP2D6, CYP2C9, and
to aromatic C18 estrogenic steroids (1) and also metabolizes
some xenobiotics (2). Inhibitors of this enzyme
are currently in use to treat postmenopausal breast
cancer and other estrogen-dependent diseases (3).
More recently, aromatase inhibitors have been identified as potential environmental toxins (so-called “endocrine disruptors”) (4). The standard method to detect
aromatase inhibitors specifies use of human placental
tissue as a source of aromatase enzyme and radiolabeled
C19 androgens as substrates (5). To eliminate
potential hazards of using human tissues or radiolabeled
materials, methods describing the use of recombinant
sources of enzyme (4, 6) and HPLC separation
with UV detection (7, 8) have been developed. However,
these methods may lack sensitivity, necessitate
use of cell culture, and are relatively laborious.
We have developed a semiautomated high-throughput
screening method utilizing recombinant human
aromatase and the fluorometric substrate O-benzylfluorescein
benzyl ester (DBF).2 The methodology is
similar to that developed previously for detecting drug
candidates with metabolism-based drug-drug interaction
potential (9). All components of the assay are
commercially available. When the assay is performed
manually, a fluorometric plate reader is the only required
instrumentation. Assays were conducted in 96-well microtiter plates
(Catalog No. 3915, Corning Costar, Cambridge, MA) in
a 200-ml volume. The substrate DBF was obtained from
Gentest Corporation (Woburn, MA). Furafylline, sulfaphenazole,
and ketoconazole were obtained from Ultrafine Chemicals limited (Manchester, UK). Quinidine,
tranylcypromine, testosterone, androstenedione, estradiol,
estrone, 4-OHA, AG, quercetin, (6)-naringenin,
chrysin, and ANF were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) and Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) were a kind gift of Dr. Willem Schoonen of N. V. Organon, the Netherlands. Aromatase enzyme (baculovirus/insect cell-expressed) was obtained from Gentest
Corporation. Characterization of the enzyme, including
steroidal aromatase activity and role in the
metabolism of xenobiotics, was as described (10). A
50% inhibitory concentration (IC50) was determined
utilizing 12 wells in each test. A cofactor/serial dilution
(C/SD) buffer was prepared in 50 mM potassium phosphate,
pH 7.4. This buffer contained 2.6 mM NADP1,
6.6 mM glucose 6-phosphate, 0.8 U/ml glucose-6-phosphate
dehydrogenase, and 0.1 mg/mL microsomal protein
prepared from insect cells infected with wild-type
virus (“control protein”). To the first well in each row,
150 ml of the test compound (dissolved in acetonitrile)
and C/SD buffer were added in a ratio of 6:144. In all
remaining wells, 100 ml of C/SD buffer containing 4%
acetonitrile was added. The final concentration of the
test substances in the first well was 0.1 to 100 mM.
Fifty microliters of the mixed solution from the first
well in each row was dispensed into the second well
and diluted serially 1:3 through the eighth well. Wells
9 and 10 contained no inhibitor and wells 11 and 12
were used as controls for background fluorescence (enzyme
and substrate were added after the reaction was
terminated). Addition of the test compounds and C/SD
buffer and serial dilutions were performed using a
Multiprobe II liquid handling station (Packard Instruments,
Downers Grove, IL). The plate was then preincubated
at 37°C for 10 min, and the reaction initiated
by the addition of 100 ml of prewarmed enzyme/substrate
(E/S) mix. The E/S mix contained buffer, cDNAexpressed
P450 (4 pmol/mL, 2 pmol/mL final), control
protein (0.4 mg/mL, 0.25 mg/mL final), substrate (0.4
mM, 0.2 mM final), and 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4. The final concentration of DBF was chosen to be approximately the K m (Table 1). Fluorescein
metabolite production was linear with time and
enzyme concentration up to 30 min and 2 pmol/mL,
respectively, and these parameters were used to determine
IC50 values. Reactions were terminated by addition
of 75 ml 2 N NaOH. To develop adequate signal to
background ratio, the plate (with lid) was then incubated for 2 h at 37°C. Fluorescence per well was measured
in top-read mode using a FLUOstar Model 403
fluorescence plate reader (BMG LabTechnologies, Inc.,
Durham, NC). Metabolite concentration was measured
using an excitation wavelength of 485 nm and an emission
wavelength of 538 nm. Data were exported and
analyzed using an Excel spreadsheet and the IC50 values
calculated by linear interpolation.
Several compounds were selected to evaluate the
assay (Table 2) and the results compared to those
found in the literature (Table 3). As shown, the assay
successfully detected the steroidal, mechanism-based
aromatase inhibitor 4-OHA (11) and the nonsteroidal
inhibitor AG in the predicted rank order. The androstenedione
analogs, Org 30365 and Org 30958, were
the most potent of all compounds examined (12). The
IC50 values found for the endogenous substrates testosterone
and androstenedione are consistent with reported
K m values of 10–80 nM (13–15). Estradiol and
estrone, the products of testosterone and androstenedione
metabolism, respectively, were found to be relatively
weak inhibitors, as expected. The flavonoid compounds
ANF, chrysin, naringenin, and quercetin were
examined based on their reported activity as aromatase
inhibitors (14). The rank order and potency
were comparable to those found previously. The assay
was also able to detect broad-spectrum cytochrome
P450 inhibitors such as the antifungal agent ketoconazole
and the monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine.
By contrast, quinidine, sulfaphenazole, and
furafylline, selective inhibitors of the drug-metabolizing
cytochrome P450 isoforms, CYP2D6, CYP2C9, and
0/5000
มนุษย์ aromatase (CYP19) แปลง C19 androgensการหอม C18 estrogenic อยด์ (1) และยัง metabolizesxenobiotics ที่บาง (2) Inhibitors ของเอนไซม์นี้มีการใช้การรักษาเต้านม postmenopausalโรคมะเร็งและโรคอื่น ๆ ขึ้นอยู่กับฮอร์โมนหญิง (3)เมื่อเร็ว ๆ นี้ การระบุ aromatase inhibitors เป็นสารพิษสิ่งแวดล้อมอาจเกิดขึ้น (เรียกว่า "ต่อมไร้ท่อ disruptors") (4) วิธีการตรวจสอบaromatase inhibitors ระบุการใช้มนุษย์รกลอกเนื้อเยื่อที่เป็นแหล่งของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeledAndrogens C19 เป็นพื้นผิว (5) เพื่อกำจัดอันตรายอาจเกิดขึ้นของการใช้เนื้อเยื่อมนุษย์ หรือ radiolabeledวัสดุ วิธีการอธิบายการใช้วททชแหล่งที่มาของเอนไซม์ (4, 6) และแยก HPLCมี UV ตรวจ (7, 8) มีการพัฒนา อย่างไรก็ตามวิธีการเหล่านี้อาจขาดการไว รบกวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ และจะค่อนข้างลำบากเราได้พัฒนา semiautomated สูงสูงวิธีคัดกรองที่ใช้มนุษย์วททชaromatase และพื้นผิว fluorometric O benzylfluoresceinbenzyl เอส (DBF) 2 วิธีคือที่พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจสอบยาเสพติดมีโต้ตอบตามเผาผลาญยายาเสพติดศักยภาพ (9) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ เมื่อทำการทดสอบด้วยตนเอง ตัวอ่านแผ่น fluorometric ได้เฉพาะจำเป็นใช้เครื่องมือ Assays ได้ดำเนินการใน microtiter ดี 96 แผ่น(แค็ตตาล็อกหมายเลข 3915 คอร์นทำ Costar เคมบริดจ์ MA) ในปริมาณ 200 ml พื้นผิวได้รับจาก DBFบริษัท Gentest (เบิร์น MA) Furafylline ซัลฟาเฟนาโซลและ ketoconazole ได้รับมาจาก Ultrafine เคมีภัณฑ์จำกัด (แมนเชสเตอร์ สหราชอาณาจักร) Quinidinetranylcypromine ฮอร์โมน androstenedione, estradiolestrone, 4-OHA, AG, quercetin (6) -naringeninchrysin และ ANF ได้รับมาจากซิกมา-Aldrich (St. Louis, MO) องค์กร 30958 (19-ethylthio-4-ene - 3,17 -dione) และองค์กร-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) ของขวัญประเภทของดร.วิลเล่ม Schoonen ของ N. V. Organon เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ Aromatase (baculovirus/แมลง แสดงเซลล์) ได้รับจาก Gentestบริษัท คุณสมบัติของเอนไซม์ รวมทั้งsteroidal aromatase กิจกรรมและบทบาทในการเผาผลาญ xenobiotics ถูกอธิบายไว้ (10) A50% (IC50) ลิปกลอสไขความเข้มข้นที่กำหนดใช้ 12 บ่อในแต่ละการทดสอบ เจือจาง cofactor/ชุดบัฟเฟอร์ (C/SD) ถูกเตรียมใน 50 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตpH 7.4 บัฟเฟอร์นี้อยู่ 2.6 มม. NADP16.6 มม.กลูโคส 6-ฟอสเฟต 0.8 U/ml กลูโคส-6-ฟอสเฟตdehydrogenase และโปรตีน microsomal 0.1 mg/mLเตรียมจากเซลล์แมลงที่ติดกับป่าชนิดไวรัส ("ควบคุมโปรตีน") การดีแรกในแต่ละแถวml 150 ของการทดสอบที่ซับซ้อน (ละลายใน acetonitrile)และเพิ่มอัตราส่วนของ 6:144 C/SD บัฟเฟอร์ ในทั้งหมดเหลือบ่อ 100 ml ของบัฟเฟอร์ C/SD ประกอบด้วย 4%acetonitrile ถูกเพิ่ม ความเข้มข้นสุดท้ายของการสารทดสอบในบ่อแรก 0.1-100 มม.Microliters 50 ของโซลูชันการผสมจากครั้งแรกในแต่ละแถวมีคำเป็นที่สองด้วยและผสม serially 1:3 ถึงวันที่แปดดี บ่อ9 และ 10 อยู่ไม่มีสารยับยั้งและบ่อ 11 และ 12ใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับพื้น fluorescence (เอนไซม์และมีเพิ่มพื้นผิวหลังจากการปฏิกิริยายกเลิก) นอกจากนี้สารทดสอบและ C/SDบัฟเฟอร์และ dilutions ประจำที่ดำเนินการโดยใช้การของเหลว II multiprobe จัดการสถานี (เครื่องมือ PackardDowners โกรฟ IL) จานที่แล้ว preincubatedที่ 37° C 10 นาที และปฏิกิริยาเริ่มต้น100 ml ของเอนไซม์ prewarmed/พื้น ผิวด้านนอก(E/S) ผสมกัน บัฟเฟอร์ E/S ผสมอยู่ cDNAexpressedP450 (pmol 4 mL, 2 pmol/mL ขั้นสุดท้าย), การควบคุมโปรตีน (0.4 mg/mL สุดท้าย 0.25 mg/mL), พื้นผิว (0.4มม. 0.2 mM ที่สุดท้าย), และ 50 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟต บัฟเฟอร์ ค่า pH 7.4 การ ความเข้มข้นสุดท้ายของ DBF ถูกเลือกให้เป็นประมาณ K m (ตาราง 1) Fluoresceinผลิต metabolite เป็นเส้นตรงกับเวลา และความเข้มข้นเอนไซม์ถึง 30 นาทีและ 2 pmol/mLตามลำดับ และพารามิเตอร์เหล่านี้ถูกใช้เพื่อกำหนดค่า IC50 ปฏิกิริยาถูกเลิกจ้าง โดยเพิ่มของ 75 ml 2 N NaOH สัญญาณที่เพียงพอเพื่อการพัฒนาอัตราส่วนพื้นหลัง จาน (มีฝา) แล้วถูก incubated สำหรับ h 2 ที่ 37 องศาเซลเซียส มีวัด fluorescence ต่อดีในโหมดอ่านด้านบนใช้กับ FLUOstar รุ่น 403อ่านแผ่น fluorescence (BMG LabTechnologies, Inc.เดอแรม NC) เป็นวัดความเข้มข้นของ metaboliteใช้ความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 485 nm และการปล่อยก๊าซความยาวคลื่นของ 538 nm ข้อมูลถูกส่งออก และวิเคราะห์โดยใช้กระดาษคำนวณ Excel และค่า IC50คำนวณ โดยสอดแทรกเชิงเส้นเลือกสารต่าง ๆ เพื่อประเมินการผลการเปรียบเทียบและทดสอบ (ตาราง 2)พบในวรรณคดี (ตาราง 3) การแสดง การทดสอบสำเร็จตรวจพบที่ steroidal ตามกลไกaromatase ผล 4-OHA (11) และ nonsteroidalสารยับยั้งที่ AG ในใบสั่งแบบลำดับขั้นคาดการณ์ Androstenedione ในanalogs องค์กร 30365 และองค์กร 30958 ถูกมีศักยภาพสูงสุดของสารทั้งหมดตรวจสอบ (12) ที่ค่า IC50 พบฮอร์โมน endogenous พื้นผิวและ androstenedione เป็นสอดคล้องกับรายงานค่า m K ของ 10 – 80 nM (13-15) Estradiol และestrone ผลิตภัณฑ์ของฮอร์โมน androstenedioneเผาผลาญ ตามลำดับ พบค่อนข้างจะอ่อนแอ inhibitors ตามที่คาดหวัง สารประกอบ flavonoidANF, chrysin, naringenin และ quercetinตรวจสอบตามกิจกรรมการรายงานเป็น aromataseinhibitors (14) ใบสั่งแบบลำดับขั้นและศักยภาพได้เทียบเท่ากับที่พบก่อนหน้านี้ การทดสอบก็ยังสามารถตรวจหา broad-spectrum cytochromeInhibitors P450 เช่น ketoconazole ต้านเชื้อราแทนและ tranylcypromine monoamine oxidase ผลโดยคมชัด quinidine ซัลฟาเฟนา โซล และfurafylline, inhibitors ที่ใช้ของตัวยา-metabolizingcytochrome P450 isoforms, CYP2D6, CYP2C9 และ
การแปล กรุณารอสักครู่..
aromatase มนุษย์ (CYP19) แปลง C19 แอนโดรเจน
ที่จะเตียรอยด์ estrogenic หอม C18 (1) และยัง metabolizes
สารแปลกปลอมบาง (2) ยับยั้งเอนไซม์นี้
กำลังอยู่ในการใช้ในการรักษามะเร็งเต้านมในวัยหมดประจำเดือน
โรคมะเร็งและโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนอื่น ๆ (3).
เมื่อเร็ว ๆ นี้ยับยั้ง aromatase ได้รับการระบุว่าเป็นสารพิษสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น (ที่เรียกว่า "สารทำลายต่อมไร้ท่อ") (4) วิธีการมาตรฐานในการตรวจสอบ
สารยับยั้ง aromatase ระบุการใช้รกของมนุษย์
เนื้อเยื่อเป็นแหล่งที่มาของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
C19 แอนโดรเจนเป็นพื้นผิว (5) เพื่อขจัด
อันตรายที่อาจเกิดจากการใช้เนื้อเยื่อของมนุษย์หรือ radiolabeled
วัสดุอุปกรณ์วิธีการอธิบายการใช้ recombinant
แหล่งที่มาของเอนไซม์ (4, 6) และการแยกสารด้วยเทคนิค HPLC
มีการตรวจสอบรังสียูวี (7, 8) ได้รับการพัฒนา แต่
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดความไวเลี่ยง
การใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์และมีความลำบากค่อนข้าง.
เรามีการพัฒนาสูงผ่าน semiautomated
วิธีการตรวจคัดกรองที่ใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และสารตั้งต้นฟลูออโร O-benzylfluorescein
เอสเตอร์เบนซิล (DBF) 0.2 วิธีการคือ
แบบเดียวกับที่ก่อนหน้านี้ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจหายาเสพติด
ผู้ที่มีการเผาผลาญอาหารที่ใช้ปฏิสัมพันธ์ยาเสพติดยาเสพติด
ที่มีศักยภาพ (9) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบที่มีการ
ใช้ในเชิงพาณิชย์ เมื่อการทดสอบจะดำเนินการ
ด้วยตนเองอ่านแผ่นฟลูออโรเป็นที่จำเป็นเพียง
เครื่องมือ การตรวจได้ดำเนินการใน 96 หลุมแผ่นไมโคร
(แคตตาล็อกฉบับที่ 3915, Corning Costar, เคมบริดจ์) ใน
ปริมาณ 200 มิลลิลิตร พื้นผิว DBF ที่ได้รับจาก
GenTest คอร์ปอเรชั่น (เคมบริดจ์) Furafylline, ซัลฟาเฟนาโซล,
และ ketoconazole ที่ได้รับจาก Ultrafine เคมีภัณฑ์ จำกัด (แมนเชสเตอร์สหราชอาณาจักร) quinidine,
tranylcypromine ฮอร์โมน androstenedione, estradiol,
estrone 4 OHA, AG, quercetin, (6) -naringenin,
Chrysin และ ANF ที่ได้รับจาก บริษัท Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์) Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) และ Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) เป็นของที่ระลึกชนิดของดร. วิลเล็ม Schoonen ของ NV ออร์กา เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ aromatase (ไวรัส / แมลงเซลล์แสดง) ที่ได้รับจาก GenTest
คอร์ปอเรชั่น คุณสมบัติของเอนไซม์รวมทั้ง
กิจกรรม aromatase เตียรอยด์และบทบาทใน
การเผาผลาญสารแปลกปลอมได้ตามที่อธิบายไว้ (10)
50% ความเข้มข้น (IC50) ถูกกำหนด
ใช้หลุม 12 ในการทดสอบแต่ละ ปัจจัย / เจือจางอนุกรม
(C / SD) กันชนได้รับการจัดทำขึ้นฟอสเฟตโพแทสเซียม 50 มิลลิเมตร,
พีเอช 7.4 บัฟเฟอร์นี้มีอยู่ 2.6 มิลลิ NADP1,
6.6 มิลลิกลูโคส 6 ฟอสเฟต 0.8 U / ml กลูโคส -6- ฟอสเฟต
dehydrogenase และ 0.1 mg / ml โปรตีนไมโคร
จัดทำขึ้นจากเซลล์แมลงที่ติดเชื้อชนิดป่า
ไวรัส ("โปรตีนควบคุม") ในการเป็นอยู่ที่ดีครั้งแรกในแต่ละแถว
150 มลสารทดสอบ (ละลายใน acetonitrile)
และบัฟเฟอร์ C / SD ถูกเพิ่มในอัตราส่วน 6: 144 ในทุก
หลุมที่เหลือ 100 มลของบัฟเฟอร์ C / SD ที่มี 4%
acetonitrile ถูกเพิ่มเข้ามา ความเข้มข้นสุดท้ายของ
สารทดสอบที่ดีเป็นครั้งแรกที่ 0.1-100 มม.
ห้าสิบ microliters ของการแก้ปัญหาการชื่นชมจากคนแรกที่
ดีในแต่ละแถวได้รับการจ่ายเป็นอย่างดีที่สอง
และปรับลดเป็นลำดับที่ 1: 3 ถึงทั้งแปด เวลส์
9 และ 10 ที่มีอยู่ไม่ยับยั้งและบ่อ 11 และ 12
ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับการเรืองแสงพื้นหลัง (เอนไซม์
และสารตั้งต้นที่ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากปฏิกิริยาถูก
ยกเลิก) การเติมสารทดสอบและ C / SD
บัฟเฟอร์และเจือจางอนุกรมถูกดำเนินการโดยใช้
สอง MultiProbe สถานีการจัดการสภาพคล่อง (เครื่องดนตรี Packard,
ดาวเนอร์สโกรฟ, IL) แผ่นถูก preincubated แล้ว
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและปฏิกิริยาที่ริเริ่ม
โดยนอกเหนือจาก 100 มล. ของเอนไซม์ prewarmed / สารตั้งต้น
(E / S) ผสม E / S ผสมบัฟเฟอร์บรรจุ cDNAexpressed
P450 (4 pmol / ml 2 pmol / mL สุดท้าย), การควบคุม
โปรตีน (0.4 mg / ml, 0.25 mg / ml สุดท้าย) สารตั้งต้น (0.4
มิลลิ, 0.2 มิลลิสุดท้าย), และ 50 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ความเข้มข้นสุดท้ายของ DBF ได้รับเลือกจะอยู่ที่ประมาณค่า K m (ตารางที่ 1) Fluorescein
ผลิต metabolite เป็นเชิงเส้นที่มีเวลาและ
ความเข้มข้นของเอนไซม์ได้ถึง 30 นาทีและ 2 pmol / ml
ตามลำดับและพารามิเตอร์เหล่านี้ถูกใช้ในการกำหนด
ค่า IC50 ปฏิกิริยาถูกยกเลิกโดยนอกเหนือ
จาก 75 มล. 2 ไม่มี NaOH เพื่อพัฒนาสัญญาณเพียงพอที่จะ
อัตราส่วนพื้นหลังแผ่น (ที่มีฝาปิด) ถูกบ่มแล้วเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C เรืองแสงได้ดีต่อวัด
ในโหมดบนอ่านได้โดยใช้ FLUOstar รุ่น 403
เครื่องอ่านแผ่นเรืองแสง (BMG LabTechnologies อิงค์
Durham, NC) ความเข้มข้น metabolite วัด
โดยใช้ความยาวคลื่นกระตุ้นของ 485 นาโนเมตรและการปล่อย
ความยาวคลื่น 538 นาโนเมตร ข้อมูลการส่งออกและการ
วิเคราะห์โดยใช้กระดาษคำนวณ Excel และค่า IC50
คำนวณโดยการสอดแทรกเชิงเส้น.
สารประกอบหลายคนเลือกที่จะประเมินผล
การทดสอบ (ตารางที่ 2) และผลที่เมื่อเทียบกับผู้
ที่พบในวรรณกรรม (ตารางที่ 3) ที่แสดงการทดสอบ
ประสบความสำเร็จในการตรวจพบ steroidal กลไกที่ใช้
ยับยั้ง aromatase 4 OHA (11) และ nonsteroidal
ยับยั้ง AG ในลำดับที่คาดการณ์ไว้ androstenedione
analogs, Org 30365 และ 30958 Org เป็น
ส่วนใหญ่ที่มีศักยภาพของสารทั้งหมดที่ตรวจสอบ (12)
ค่า IC50 พบพื้นผิวภายนอกฮอร์โมนเพศชาย
และ androstenedione มีความสอดคล้องกับรายงาน
ค่า K m ค่า 10-80 นาโนเมตร (13-15) estradiol และ
estrone ผลิตภัณฑ์ของฮอร์โมนเพศชายและ androstenedione
การเผาผลาญอาหารตามลำดับพบว่ามีค่อนข้าง
ยับยั้งอ่อนแอตามที่คาดไว้ flavonoid สาร
ANF, Chrysin, naringenin และ quercetin ถูก
ตรวจสอบการขึ้นอยู่กับกิจกรรมของพวกเขาเป็นรายงาน aromatase
สารยับยั้ง (14) ลำดับและความแข็งแรง
ถูกเปรียบเทียบกับที่พบก่อนหน้านี้ การทดสอบ
ก็ยังสามารถที่จะตรวจสอบในวงกว้างสเปกตรัม cytochrome
P450 ยับยั้งเช่น ketoconazole ตัวแทนเชื้อรา
และยับยั้งเอนไซม์ monoamine tranylcypromine.
ตรงกันข้าม quinidine, ซัลฟาเฟนาโซลและ
furafylline ยับยั้งการคัดเลือกยาเมแทบ
ไอโซฟอร์ม cytochrome P450, CYP2D6, CYP2C9 และ
ที่จะเตียรอยด์ estrogenic หอม C18 (1) และยัง metabolizes
สารแปลกปลอมบาง (2) ยับยั้งเอนไซม์นี้
กำลังอยู่ในการใช้ในการรักษามะเร็งเต้านมในวัยหมดประจำเดือน
โรคมะเร็งและโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนอื่น ๆ (3).
เมื่อเร็ว ๆ นี้ยับยั้ง aromatase ได้รับการระบุว่าเป็นสารพิษสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น (ที่เรียกว่า "สารทำลายต่อมไร้ท่อ") (4) วิธีการมาตรฐานในการตรวจสอบ
สารยับยั้ง aromatase ระบุการใช้รกของมนุษย์
เนื้อเยื่อเป็นแหล่งที่มาของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
C19 แอนโดรเจนเป็นพื้นผิว (5) เพื่อขจัด
อันตรายที่อาจเกิดจากการใช้เนื้อเยื่อของมนุษย์หรือ radiolabeled
วัสดุอุปกรณ์วิธีการอธิบายการใช้ recombinant
แหล่งที่มาของเอนไซม์ (4, 6) และการแยกสารด้วยเทคนิค HPLC
มีการตรวจสอบรังสียูวี (7, 8) ได้รับการพัฒนา แต่
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดความไวเลี่ยง
การใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์และมีความลำบากค่อนข้าง.
เรามีการพัฒนาสูงผ่าน semiautomated
วิธีการตรวจคัดกรองที่ใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และสารตั้งต้นฟลูออโร O-benzylfluorescein
เอสเตอร์เบนซิล (DBF) 0.2 วิธีการคือ
แบบเดียวกับที่ก่อนหน้านี้ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจหายาเสพติด
ผู้ที่มีการเผาผลาญอาหารที่ใช้ปฏิสัมพันธ์ยาเสพติดยาเสพติด
ที่มีศักยภาพ (9) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบที่มีการ
ใช้ในเชิงพาณิชย์ เมื่อการทดสอบจะดำเนินการ
ด้วยตนเองอ่านแผ่นฟลูออโรเป็นที่จำเป็นเพียง
เครื่องมือ การตรวจได้ดำเนินการใน 96 หลุมแผ่นไมโคร
(แคตตาล็อกฉบับที่ 3915, Corning Costar, เคมบริดจ์) ใน
ปริมาณ 200 มิลลิลิตร พื้นผิว DBF ที่ได้รับจาก
GenTest คอร์ปอเรชั่น (เคมบริดจ์) Furafylline, ซัลฟาเฟนาโซล,
และ ketoconazole ที่ได้รับจาก Ultrafine เคมีภัณฑ์ จำกัด (แมนเชสเตอร์สหราชอาณาจักร) quinidine,
tranylcypromine ฮอร์โมน androstenedione, estradiol,
estrone 4 OHA, AG, quercetin, (6) -naringenin,
Chrysin และ ANF ที่ได้รับจาก บริษัท Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์) Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) และ Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) เป็นของที่ระลึกชนิดของดร. วิลเล็ม Schoonen ของ NV ออร์กา เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ aromatase (ไวรัส / แมลงเซลล์แสดง) ที่ได้รับจาก GenTest
คอร์ปอเรชั่น คุณสมบัติของเอนไซม์รวมทั้ง
กิจกรรม aromatase เตียรอยด์และบทบาทใน
การเผาผลาญสารแปลกปลอมได้ตามที่อธิบายไว้ (10)
50% ความเข้มข้น (IC50) ถูกกำหนด
ใช้หลุม 12 ในการทดสอบแต่ละ ปัจจัย / เจือจางอนุกรม
(C / SD) กันชนได้รับการจัดทำขึ้นฟอสเฟตโพแทสเซียม 50 มิลลิเมตร,
พีเอช 7.4 บัฟเฟอร์นี้มีอยู่ 2.6 มิลลิ NADP1,
6.6 มิลลิกลูโคส 6 ฟอสเฟต 0.8 U / ml กลูโคส -6- ฟอสเฟต
dehydrogenase และ 0.1 mg / ml โปรตีนไมโคร
จัดทำขึ้นจากเซลล์แมลงที่ติดเชื้อชนิดป่า
ไวรัส ("โปรตีนควบคุม") ในการเป็นอยู่ที่ดีครั้งแรกในแต่ละแถว
150 มลสารทดสอบ (ละลายใน acetonitrile)
และบัฟเฟอร์ C / SD ถูกเพิ่มในอัตราส่วน 6: 144 ในทุก
หลุมที่เหลือ 100 มลของบัฟเฟอร์ C / SD ที่มี 4%
acetonitrile ถูกเพิ่มเข้ามา ความเข้มข้นสุดท้ายของ
สารทดสอบที่ดีเป็นครั้งแรกที่ 0.1-100 มม.
ห้าสิบ microliters ของการแก้ปัญหาการชื่นชมจากคนแรกที่
ดีในแต่ละแถวได้รับการจ่ายเป็นอย่างดีที่สอง
และปรับลดเป็นลำดับที่ 1: 3 ถึงทั้งแปด เวลส์
9 และ 10 ที่มีอยู่ไม่ยับยั้งและบ่อ 11 และ 12
ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับการเรืองแสงพื้นหลัง (เอนไซม์
และสารตั้งต้นที่ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากปฏิกิริยาถูก
ยกเลิก) การเติมสารทดสอบและ C / SD
บัฟเฟอร์และเจือจางอนุกรมถูกดำเนินการโดยใช้
สอง MultiProbe สถานีการจัดการสภาพคล่อง (เครื่องดนตรี Packard,
ดาวเนอร์สโกรฟ, IL) แผ่นถูก preincubated แล้ว
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและปฏิกิริยาที่ริเริ่ม
โดยนอกเหนือจาก 100 มล. ของเอนไซม์ prewarmed / สารตั้งต้น
(E / S) ผสม E / S ผสมบัฟเฟอร์บรรจุ cDNAexpressed
P450 (4 pmol / ml 2 pmol / mL สุดท้าย), การควบคุม
โปรตีน (0.4 mg / ml, 0.25 mg / ml สุดท้าย) สารตั้งต้น (0.4
มิลลิ, 0.2 มิลลิสุดท้าย), และ 50 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ความเข้มข้นสุดท้ายของ DBF ได้รับเลือกจะอยู่ที่ประมาณค่า K m (ตารางที่ 1) Fluorescein
ผลิต metabolite เป็นเชิงเส้นที่มีเวลาและ
ความเข้มข้นของเอนไซม์ได้ถึง 30 นาทีและ 2 pmol / ml
ตามลำดับและพารามิเตอร์เหล่านี้ถูกใช้ในการกำหนด
ค่า IC50 ปฏิกิริยาถูกยกเลิกโดยนอกเหนือ
จาก 75 มล. 2 ไม่มี NaOH เพื่อพัฒนาสัญญาณเพียงพอที่จะ
อัตราส่วนพื้นหลังแผ่น (ที่มีฝาปิด) ถูกบ่มแล้วเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C เรืองแสงได้ดีต่อวัด
ในโหมดบนอ่านได้โดยใช้ FLUOstar รุ่น 403
เครื่องอ่านแผ่นเรืองแสง (BMG LabTechnologies อิงค์
Durham, NC) ความเข้มข้น metabolite วัด
โดยใช้ความยาวคลื่นกระตุ้นของ 485 นาโนเมตรและการปล่อย
ความยาวคลื่น 538 นาโนเมตร ข้อมูลการส่งออกและการ
วิเคราะห์โดยใช้กระดาษคำนวณ Excel และค่า IC50
คำนวณโดยการสอดแทรกเชิงเส้น.
สารประกอบหลายคนเลือกที่จะประเมินผล
การทดสอบ (ตารางที่ 2) และผลที่เมื่อเทียบกับผู้
ที่พบในวรรณกรรม (ตารางที่ 3) ที่แสดงการทดสอบ
ประสบความสำเร็จในการตรวจพบ steroidal กลไกที่ใช้
ยับยั้ง aromatase 4 OHA (11) และ nonsteroidal
ยับยั้ง AG ในลำดับที่คาดการณ์ไว้ androstenedione
analogs, Org 30365 และ 30958 Org เป็น
ส่วนใหญ่ที่มีศักยภาพของสารทั้งหมดที่ตรวจสอบ (12)
ค่า IC50 พบพื้นผิวภายนอกฮอร์โมนเพศชาย
และ androstenedione มีความสอดคล้องกับรายงาน
ค่า K m ค่า 10-80 นาโนเมตร (13-15) estradiol และ
estrone ผลิตภัณฑ์ของฮอร์โมนเพศชายและ androstenedione
การเผาผลาญอาหารตามลำดับพบว่ามีค่อนข้าง
ยับยั้งอ่อนแอตามที่คาดไว้ flavonoid สาร
ANF, Chrysin, naringenin และ quercetin ถูก
ตรวจสอบการขึ้นอยู่กับกิจกรรมของพวกเขาเป็นรายงาน aromatase
สารยับยั้ง (14) ลำดับและความแข็งแรง
ถูกเปรียบเทียบกับที่พบก่อนหน้านี้ การทดสอบ
ก็ยังสามารถที่จะตรวจสอบในวงกว้างสเปกตรัม cytochrome
P450 ยับยั้งเช่น ketoconazole ตัวแทนเชื้อรา
และยับยั้งเอนไซม์ monoamine tranylcypromine.
ตรงกันข้าม quinidine, ซัลฟาเฟนาโซลและ
furafylline ยับยั้งการคัดเลือกยาเมแทบ
ไอโซฟอร์ม cytochrome P450, CYP2D6, CYP2C9 และ
การแปล กรุณารอสักครู่..
aromatase มนุษย์ ( cyp19 ) แปลง c19 androgens
จะหอม c18 estrogenic สเตียรอยด์ ( 1 ) และยัง เผาผลาญ
บาง xenobiotics ( 2 ) สารยับยั้งเอนไซม์นี้
มีใช้อยู่ในปัจจุบันเพื่อรักษามะเร็งเต้านม
วัยทองและอื่น ๆโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนเอสโตรเจน ( 3 ) .
เมื่อเร็ว ๆ นี้ aromatase inhibitors ได้รับการระบุเป็นพิษต่อสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น ( เรียกว่า " disruptors " ต่อมไร้ท่อ ) ( 4 )วิธีมาตรฐานเพื่อตรวจหา
คนไทยใช้ aromatase inhibitors ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อมนุษย์เป็นแหล่งของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
c19 androgens เช่นพื้นผิว ( 5 ) เพื่อขจัดอันตรายที่อาจเกิดขึ้นจากการใช้อวัยวะมนุษย์
หรือ radiolabeled วัสดุ วิธีการ การใช้แหล่งโปรตีนของเอนไซม์
( 4 , 6 ) และ HPLC แยก
ตรวจจับยูวี ( 7 , 8 ) ได้รับการพัฒนา อย่างไรก็ตาม
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดไว , necessitate
ใช้เซลล์เพาะเลี้ยง และค่อนข้างลําบาก เราได้พัฒนา semiautomated
ช่วยคัดกรองวิธีใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และ fluorometric พื้นผิว o-benzylfluorescein
เบนซิลเอสเทอร์ ( DBF ) 2 โดย
คล้ายกับที่พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจหายาเสพติด
จะหอม c18 estrogenic สเตียรอยด์ ( 1 ) และยัง เผาผลาญ
บาง xenobiotics ( 2 ) สารยับยั้งเอนไซม์นี้
มีใช้อยู่ในปัจจุบันเพื่อรักษามะเร็งเต้านม
วัยทองและอื่น ๆโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนเอสโตรเจน ( 3 ) .
เมื่อเร็ว ๆ นี้ aromatase inhibitors ได้รับการระบุเป็นพิษต่อสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น ( เรียกว่า " disruptors " ต่อมไร้ท่อ ) ( 4 )วิธีมาตรฐานเพื่อตรวจหา
คนไทยใช้ aromatase inhibitors ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อมนุษย์เป็นแหล่งของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
c19 androgens เช่นพื้นผิว ( 5 ) เพื่อขจัดอันตรายที่อาจเกิดขึ้นจากการใช้อวัยวะมนุษย์
หรือ radiolabeled วัสดุ วิธีการ การใช้แหล่งโปรตีนของเอนไซม์
( 4 , 6 ) และ HPLC แยก
ตรวจจับยูวี ( 7 , 8 ) ได้รับการพัฒนา อย่างไรก็ตาม
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดไว , necessitate
ใช้เซลล์เพาะเลี้ยง และค่อนข้างลําบาก เราได้พัฒนา semiautomated
ช่วยคัดกรองวิธีใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และ fluorometric พื้นผิว o-benzylfluorescein
เบนซิลเอสเทอร์ ( DBF ) 2 โดย
คล้ายกับที่พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจหายาเสพติด
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Inside the rooms have tobacco grinding o
- การเตรียมตัวเริ่มต้นเราก็เลือกเพลง
- กดเปลี่ยนภาษาไม่ได้
- I will give you all the happiness in the
- ทีใครทีมัน
- ฉันชื่อ มาวิน ฉันเรียนที่โรงเรียนนักบุญเ
- ผู้จัดทำรายงาน
- ความหมายของหลักสูตร คำว่า “หลักสูตร” หรื
- elements
- Press Alt or F6 or F10 to select the fir
- 人老了，干一会儿就腰疼
- FOR The horse-loving pharmacist owner of
- ถึงเวลาประมาณเกือบยี่สิบนาฬิกา
- Just to see you I dream night.Good night
- ข้อดี ของการใช้ Facebook คือ ได้แชร์ไอเด
- ของเล่น
- สรุป จะเห็นได้ว่าการควบคุมอาหารนั้นมีท้ง
- Are you really serious about me?
- acceptance accessibility accomplishment
- คาดหวัง
- ความหมายของหลักสูตร คำว่า “หลักสูตร” หรื
- ขับมอเตอร์ไซต์มาโรงเรียนทุกวัน
- Why the student often translated wrong
- เลื่อยรอปากไม้ เลื่อยลันดา
