2.4. Optimization of the reaction c

2.4. Optimization of the reaction conditions for mRT-PCRThe virus-specific primer sets with high amplification efficien-cies were selected for further evaluation in multiplex RT-PCR (mRT-PCR) (Table 1). The mRT-PCR was optimized by varying theconcentrations of reaction components and cycling conditions. Theannealing temperature was increased from 50 to 65◦C by every5◦C incremental temperature unit. Different concentration combi-nations of three primer sets selected were then tested to balancevirus-specific band densities at the selected annealing temperature.Finally, optimal PCR amplifications were performed in a 25 ?l reac-tion volume comprising 5.5 ?l of template cDNA, 0.08 ?M ASGVprimers, 0.16 ?M ACLSV primers and 0.24 ?M ASPV primers, 2.5 ?l10× PCR buffer, 0.2 mM each dNTP, and 2.5 U Taq DNA polymerase.Multiplex PCR amplification parameters were as follows: 94◦C for5 min; 35 cycles of 94◦C for 1 min, 60◦C for 1 min, and 72◦C for1.5 min, and a final incubation for 10 min at 72◦C. The PCR prod-ucts were electrophoresed on 2% agarose gels in TAE buffer andvisualized by staining with ethidium bromide (0.5 ?g/ml) underUV illumination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาสำหรับ MRT-pcrthe ไวรัสเฉพาะชุดไพรเมอร์ที่มีการขยายสูง EFFICIEN Cies ถูกเลือกสำหรับการประเมินผลต่อไปใน multiplex RT-PCR (MRT-PCR) (ตารางที่ 1) MRT-PCR ถูกปรับให้เหมาะสมโดย theconcentrations ที่แตกต่างกันของส่วนประกอบของปฏิกิริยาและเงื่อนไขการขี่จักรยานอุณหภูมิ theannealing เพิ่มขึ้น 50-65 ◦คโดย every5 ◦คหน่วยอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น ความเข้มข้นของรถเข็น combi ประเทศที่แตกต่างกันของสามชุดไพรเมอร์ที่เลือกได้มีการทดสอบแล้ว balancevirus เฉพาะความหนาแน่นของวงดนตรีที่หลอมเลือก temperature.finally, amplifications pcr ที่ดีที่สุดได้รับการดำเนินการใน 25? ลิตรปริมาณ reac-tion ประกอบด้วย 5.5? ลิตรของแม่แบบ cDNA 0.08 ? เมตร asgvprimers,? ไพรเมอร์ 0.16 เมตรและ 0.24 aclsv ไพรเมอร์เมตร aspv 2.5 L10 × pcr บัฟเฟอร์, 0.2 มม. แต่ละ dntp และ 2.5 u TAQ dna polymerase.multiplex พารามิเตอร์ขยาย pcr มีดังนี้? 94 ◦ค for5 นาที; 35 รอบจาก 94 ◦ คเป็นเวลา 1 นาที 60 ◦ C เป็นเวลา 1 นาทีและ 72 ◦ค for1.5 นาทีและการบ่มขั้นสุดท้ายสำหรับ 10 นาทีที่ 72 ◦คpcr แยง ucts ถูก electrophoresed 2% เจล agarose ในบัฟเฟอร์ tae andvisualized โดยย้อมสีด้วย ethidium โบรไมด์ (0.5? g / ml) แสงสว่าง underuv

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การปรับเงื่อนไขปฏิกิริยาสำหรับรองพื้นเฉพาะไวรัส mRT PCRThe ชุดกับขยายสูง efficien cies ถูกเลือกสำหรับการประเมินเพิ่มเติมใน multiplex RT-PCR (mRT-PCR) (ตาราง 1) รถไฟ-PCR ถูกปรับ theconcentrations ประกอบปฏิกิริยาแตกต่างกัน และเงื่อนไขการขี่จักรยาน Theannealing อุณหภูมิเพิ่มขึ้นจาก 50 ไป 65◦C every5◦C หน่วยอุณหภูมิเพิ่มขึ้น ประเทศ combi ความเข้มข้นแตกต่างกันของสามชุดของพื้นที่เลือกได้แล้วทดสอบเพื่อความหนาแน่นของวง balancevirus เฉพาะเลือกหลอมอุณหภูมิในที่สุด ดำเนิน amplifications PCR ที่ดีที่สุดใน 25 ตัว? l สเตรชัน reac เสียงประกอบ 5.5 ? l แม่ cDNA, 0.08M ASGVprimers 0.16M ACLSV ไพรเมอร์และ 0.24M ASPV ไพรเมอร์ 2.5 ? l10 การ PCR บัฟเฟอร์ 0.2 mM dNTP และ 2.5 U Taq DNA พอลิเมอเรสMultiplex PCR ขยายพารามิเตอร์ได้ดังนี้: 94◦C for5 นาที รอบ 35 ของ 94◦C ในนาทีที่ 1, 60◦C 1 นาที และ 72◦C for1.5 นาที และฟักตัวสุดท้ายใน 10 นาทีที่ 72◦C PCR ผลิต-ucts มี electrophoresed บน agarose 2% ใน andvisualized เต้บัฟเฟอร์ โดยการย้อมสีด้วยโบรไมด์ ethidium (0.5 ? g/ml) รัศมี underUV

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การปรับแต่ง ประสิทธิภาพ ของเงื่อนไขการตอบสนองสำหรับตั้งค่ารถไฟฟ้าใต้ดิน - pcrthe ไวรัส - เฉพาะเชื้อปะทุพร้อมด้วยการขยายสัญญาณเสียงสูง efficien - cies ถูกเลือกสำหรับการประเมินเพิ่มเติมในแบบมัลติเพล็กซ์ Rt - pcr (สถานีรถไฟฟ้าใต้ดิน - pcr )(ตารางที่ 1 ) รถไฟฟ้าใต้ดิน - pcr ซึ่งเป็นการปรับแต่งได้หลากหลาย theconcentrations ของส่วนประกอบการตอบสนองและการขี่จักรยานเงื่อนไขอุณหภูมิ theannealing ก็เพิ่มขึ้นจาก 50 เป็น 65 ◦c โดยหน่วย อุณหภูมิ เพิ่มขึ้น 5 ◦c ทุกครั้ง แตกต่างกันไปความเข้มข้นแบบผสมของเชื้อปะทุ 3 ชุดที่เลือกได้รับการทดสอบแล้วกับ balancevirus เฉพาะหนาแน่นคลื่นความถี่ที่เลือกไว้ annealing อุณหภูมิ .สุดท้าย,ดีที่สุด pcr amplifications นั้นดำเนินการในที่ 25 ? L reac - การปรับระดับเสียงประกอบด้วย 5.5 ? L ของ cdna เทมเพลต, 0.08 ?ม. asgvprimers ,0.16 ?ม. aclsv primers และ 0.24 ?ม. aspv primers , 2.5 ? L 10 × pcr buffer , 0.2 มม.แต่ละ dntp ,และ 2.5 U taq polymerase ดีเอ็นเอ.แบบมัลติเพล็กซ์ pcr พารามิเตอร์การขยายสัญญาณเสียงมีดังนี้ 94 ◦c สำหรับ 5 นาที; 35 รอบ 94 ◦c สำหรับ 1 นาที, 60 ◦c สำหรับ 1 นาทีและ 72 ◦c สำหรับ 1.5 นาทีและสุดท้ายอบสำหรับ 10 นาทีที่ 72 ◦c .pcr จ้ำจี้จ้ำไช - ucts electrophoresed ที่มีใน ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจล agarose 2% ใน andvisualized บัฟเฟอร์เทควันโดโดยเกิดรอยเปื้อนควรมี ethidium ไม่น่าทึ่ง( 0.5 ? G /มล.)ไฟส่อง underuv