Establishing controls for S. agalac

Establishing controls for S. agalactiae DNA in tilapia tissue
Genomic DNA was extracted from frozen and paraffin-waxembedded
tilapia tissue to establish a positive control for S. agalactiae.
Forty tilapia weighing less than 20 g from the S. agalactiae-negative
farms were intraperitoneally inoculated with 100 μL of a solution containing
109 CFU/mL S. agalactiae (ST991 strain). The fish were euthanized
48 hours post-inoculation by anesthetizing them with 5% (w/v)
tricaine methanesulfonate (MS-222) (Argent Chemical Laboratories,
Redmon WA, USA) and cutting their spinal cords. The brains and
eyes from 20 animals were individually suspended in 1×TE buffer
(10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and frozen at −20 °C. DNA
was extracted by using an UltraClean Cells & Tissue DNA isolation
kit (Mo Bio Laboratories Inc., USA), visualized by 1.5% agarose gel
electrophoresis to observe DNA integrity, and quantified by using a
Qubit fluorometer (Invitrogen Life Technologies, USA). The DNA was
then diluted to a final 10 ng/mL concentration with 1×TE buffer
and kept at −20 °C until use. The remaining 20 brains and the eyes
were fixed in 3.7% buffered formalin for 24 h and then individually
embedded in paraffin-wax blocks. Twenty 3–4 μm thick sections
were cut separately from both brain and eyes and then placed into
vials to be deparafinized with absolute xylene for 25 min at 60 °C. Following
a second xylene treatment, the vials were spun at 14,000 rpm
for 10 min, the supernatant was discarded and the samples were
washed twice with 1 mL of absolute ethanol. The tissues were washed
once with 70% ethanol and hydrated in 1× TE buffer, pH 8.0, for
5 minutes at 55 °C (Coura et al., 2005). The DNA was extracted and
quantified as described above.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สร้างตัวควบคุมสำหรับ S. agalactiae ดีเอ็นเอในเนื้อเยื่อปลานิลGenomic DNA ที่สกัดจากแช่พาราฟิน waxembedded และเนื้อเยื่อของปลานิลจะสร้างตัวควบคุมค่าบวกสำหรับ S. agalactiaeปลานิลสี่สิบที่น้ำหนักน้อยกว่า 20 กรัมจาก S. agalactiae-ลบฟาร์มมี inoculated กับ μL 100 ของโซลูชันที่ประกอบด้วย intraperitoneallyAgalactiae CFU/mL S. 109 (ต้องใช้ ST991) ปลาที่ euthanizedinoculation หลัง 48 ชั่วโมง โดย anesthetizing 5% (w/v)tricaine methanesulfonate (MS-222) (สีเงินเคมีปฏิบัติRedmon WA สหรัฐอเมริกา) และตัดสายไฟของสไปนัล สมอง และแต่ละตาจากสัตว์ 20 ถูกหยุดชั่วคราวในบัฟเฟอร์ TE × 1(10 mM 1 mM EDTA, pH 8.0, TrisHCl) และแช่แข็งที่ −20 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอถูกสกัด โดยใช้การแยกดีเอ็นเอเนื้อเยื่อและเซลล์ UltraCleanชุด (Mo ชีวภาพ Laboratories Inc., USA), visualized โดย 1.5% agarose เจลสังเกตความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ electrophoresis และ quantified โดยการFluorometer Qubit (Invitrogen ชีวิตเทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอถูกแล้ว ยกเว้นจะเป็นสุดท้าย 10 ng/mL ความเข้มข้นกับบัฟเฟอร์ TE × 1และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนกว่าจะใช้ ตาและสมอง 20 ที่เหลือไม่ถาวรใน 3.7% buffered formalin ใน 24 ชมแล้วแต่ละฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟินบล็อก 20 3-4 μm หนาส่วนตัดแยกจากสมองและสายตา และอยู่ในvials ให้ deparafinized กับไซสัมบูรณ์สำหรับ 25 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส ต่อไปนี้รักษาไซสอง vials ถูกปั่นที่ 14000 รอบต่อนาทีใน 10 นาที supernatant ถูกละทิ้ง และตัวอย่างดีล้างสองครั้ง ด้วย 1 mL ของแอบโซลูทเอทานอล เนื้อเยื่อถูกล้างเมื่อ ด้วย 70% เอทานอลและ TE × 1 ผลิตภัณฑ์ในบัฟเฟอร์ pH 8.0 สำหรับ5 นาทีที่ 55 ° C (Coura et al., 2005) ดีเอ็นเอถูกสกัด และquantified ที่อธิบายข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ควบคุมการสร้างดีเอ็นเอ S. agalactiae
ในเนื้อเยื่อปลานิลจีโนมดีเอ็นเอที่สกัดจากแช่แข็งและพาราฟินwaxembedded
เนื้อเยื่อปลานิลเพื่อสร้างการควบคุมในเชิงบวกสำหรับเอส agalactiae.
สี่สิบปลานิลที่มีน้ำหนักน้อยกว่า 20 กรัมจาก S. agalactiae
ลบฟาร์มถูกเชื้อintraperitoneally 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาที่มี
109 โคโลนี / มิลลิลิตร S. agalactiae (สายพันธุ์ ST991) ปลาถูก euthanized
48 ชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีนโดย anesthetizing พวกเขาด้วย 5% (w / v)
tricaine methanesulfonate (MS-222) (เงินเคมีห้องปฏิบัติการ,
Redmon WA, USA) และตัดสายกระดูกสันหลังของพวกเขา สมองและสายตาจาก 20 สัตว์ที่ถูกระงับเป็นรายบุคคลใน 1 ×บัฟเฟอร์ TE (10 มิลลิ TrisHCl 1 มิลลิ EDTA, pH 8.0) และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้เซลล์และเนื้อเยื่อ ultraclean แยกดีเอ็นเอชุด(ไบโอโม Laboratories Inc. , USA) มองเห็น 1.5% agarose เจลอิเล็กจะสังเกตเห็นความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอและวัดโดยใช้fluorometer qubit (Invitrogen เทคโนโลยีชีวิตสหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอที่ได้รับการปรับลดแล้วจะเป็นครั้งสุดท้าย 10 นาโนกรัม / มิลลิลิตรเข้มข้น 1 ×บัฟเฟอร์ TE และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งาน ส่วนที่เหลืออีก 20 สมองและดวงตาได้รับการแก้ไขใน3.7% ฟอร์มาลินบัฟเฟอร์เวลา 24 ชั่วโมงแล้วเป็นรายบุคคลที่ฝังอยู่ในบล็อกพาราฟินขี้ผึ้ง ยี่สิบ 3-4 ไมโครเมตรส่วนหนาถูกตัดแยกต่างหากจากทั้งสมองและดวงตาแล้ววางลงในขวดที่จะdeparafinized กับไซลีนแน่นอนสำหรับ 25 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส ต่อไปนี้การรักษาไซลีนที่สองขวดที่ถูกหมุน 14,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา10 นาทีที่ใสทิ้งและตัวอย่างที่ถูกล้างครั้งที่สอง1 มิลลิลิตรของเอทานอลที่แน่นอน เนื้อเยื่อถูกล้างครั้งเดียวกับเอทานอล 70% และไฮเดรทใน 1 ×บัฟเฟอร์ TE ค่า pH 8.0 สำหรับ 5 นาทีที่ 55 ° C (Coura et al., 2005) ดีเอ็นเอที่ถูกสกัดและปริมาณที่อธิบายข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

The park.The park.The park.The park.The park.