DNA extraction and amplification of

DNA extraction and amplification of the ITS rDNA regions
Advanced Biomedical Research
Medknow Publications
Use of restriction fragment length polymorphism to identify Candida species, related to onychomycosis

Rasoul Mohammadi, Parisa Badiee, [...], and Farnaz Heshmat

Additional article information
Abstract
Background:

Onychomycosis is one of the most common clinical forms of fungal infections due to both filamentous fungi and yeasts. The genus of Candida is one of the most prominent causes of onychomycosis in all around the world. Although Candida albicans is still the most frequent cause of nail infections, use of broad-spectrum antifungal agents has led to a shift in the etiology of C. albicans to non-albicans species. The aim of the present study is rapid and precise identification of candida species isolated from nail infection by using of PCR-RFLP technique.
Materials and Methods:

A total of 360 clinical yeast strains were collected from nail infections in Iran. Genomic DNA was extracted using FTA; cards. ITS1-5.8SrDNA-ITS2 region was amplified using universal primers and subsequently products were digested with the restriction enzyme MspI. For identification of newly described species (C. parapsilosis complex), the SADH gene was amplified, followed by digestion with Nla III restriction enzyme.
Results:

Candida albicans was the most commonly isolated species (41.1%), followed by C. parapsilosis (21.4%), C. tropicalis (12.8%), C. kefyr (9.4%), C. krusei (5.5%), C. orthopsilosis (4.1%), C. glabrata (2.8%), C. guilliermondii (1.4%), C. rugosa (0.8%), and C. lusitaniae (0.5%). Patients in the age groups of 51-60 and 81-90 years had the highest and lowest distribution of positive specimens, respectively.
Conclusion:

Rapid and precise identification of Candida species from clinical specimens lead to appropriate therapeutic plans.
Keywords: Candida species, onychomycosis, PCR-RFLP
INTRODUCTION

Onychomycosis encloses all fungal infections of the nail due to filamentous and yeast fungi, accounted for up to 50% of all nail disorders which ranging from distal and lateral subungual, superficial, proximal subungual and dystrophic onychomycosis; however, in immunocompromised hosts can present a more significant health problem.[1,2] Studies have shown that the prevalence of onychomycosis increases with age and reasons for the age-related raise in onychomycosis may contain deficient circumferential circulation, repeated nail trauma, longer exposure to pathogenic fungi, diabetes, dysfunction of immune system, incompetence to cut the toenails or keep good foot considerations.[3,4] Moreover, numerous factors exist for increasing the prevalence of onychomycosis in modern life such as wearing of shoes especially high-heeled shoes, high moisture areas (gymnasium and wrestling mattresses by great numbers of people), use of broad-spectrum antibiotics, and corticosteroid therapy.[5] Although dermatophyte species cause 90% of toenails onychomycosis, Candida specie is considered as one of the most important causes of fingernail onychomycosis.[6,7] Candida albicans is the most prevalent species that can cause Candida nail infections and invades the entire nail plate, but onycholysis and paronychia may occur.[7] In cases of the nail Candida infections, accurate identification of causative agents at the species level is crucially important due to rapid development of resistance of some species to antifungal drugs, for instance C. krusei is innately resistant to fluconazole, and C. glabrata is able to be resistant.[8] Therefore, due to the high degree of phenotypic similarity between Candida species, identification problems are imminent. Conventional approaches for identification down to the species level in the diagnostic laboratory are based on morphological and physiological criteria, need several days or weeks to be concluded, and are frequently unspecific. However, today molecular identification methods are well established, e.g., restriction fragment length polymorphisms (RFLP), RFLP with hybridization probes, randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, electrophoretic karyotyping, and sequencing. The latter method is relatively expensive, [9] therefore, alternative molecular tools with sufficient specificity, reproducibility and sensitivity are necessary.[9,10] Thus, in the present study, we used polymerase chain reaction (PCR) to amplify the entire internal transcribed spacer (ITS)-rDNA region and secondary alcohol dehydrogenase (SADH) gene, followed by RFLP analysis for identification of Candida species were obtained from onychomycosis.
MATERIALS AND METHODS
Fungal strains

A total of 360 clinical yeast strains were obtained from nail infections of patients at Tehran, Isfahan, Alborz, Kashan, and Mazandaran provinces of Iran, from April 2009 to June 2011. All strains were cultured on sabouraud glucose agar (Difco, Detroit, MI, USA) and incubated at 28-30°C for 48 h. A loopful of single and fresh colonies of each strain was transferred to glycerol 20% and stored at –20°C prior to use.
DNA extraction and amplification of the ITS rDNA regions

Genomic DNA was extracted using FTA® Elute Micro Cards (Whatman Inc., Clifton, NJ, USA) according to the manufacturer's instructions.[11] Briefly, fresh colony was suspended in 100 μl of sterile water, then 4 μl of the suspension was dribbled on a disc of FTA card (3 mm in diameter), subsequently incubated at room temperature for at least 3 hours. The dried papers were eluted in 500 μl distilled water for a few seconds. FTA card was transferred to a new tube containing 30 μl distilled water and incubated at 95°C for 25 minutes. At last the paper discs were taken away and the water containing DNA was kept at –20°C. The internal transcribed spacer region (ITS1-5.8SrDNA-ITS2) region was amplified by using two universal ITS1 (5Ͳ-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3Ͳ) and ITS4 (5Ͳ-TCCTCC GCT TATTGATATGC-3Ͳ) primers.[12] PCR reactions were performed on a Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 25 μl volumes containing 25 ng of template DNA, 2.5 μl reaction buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 M KCl, 15 mM MgCl2, 0.1% gelatine, 1% Triton X-100), 0.1 mM of each dNTP and 1.0 U Taq DNA polymerase. Amplification was performed with cycles of 2 min at 94°C for primary denaturation, followed by 35 cycles at 95°C (30 s), 55°C (45 s) and 72°C (60 s), with a final 7 min extension step at 72°C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สกัดดีเอ็นเอและขยายขอบเขตของ rDNAงานวิจัยทางชีวการแพทย์ขั้นสูงสิ่งพิมพ์ Medknowใช้ข้อจำกัดส่วนความยาวโพลิมอร์ฟิซึมระบุโรคพันธุ์ ที่เกี่ยวข้องกับ onychomycosisRasoul Mohammadi, Parisa Badiee, [...], และ Farnaz Heshmatรายละเอียดเพิ่มเติมบทคัดย่อพื้นหลัง:Onychomycosis เป็นหนึ่งในแบบฟอร์มทางคลินิกทั่วไปของการติดเชื้อราเชื้อรา filamentous และ yeasts ตระกูลนี้ของแคนเป็นหนึ่งในสาเหตุที่โดดเด่นที่สุดของ onychomycosis ในทั่วโลก แม้ว่า Candida albicans เป็นสาเหตุของการติดเชื้อที่เล็บบ่อย ใช้แทน broad-spectrum ต้านเชื้อราได้นำไปกะในวิชาการของ C. albicans albicans ไม่ใช่สปีชีส์ จุดมุ่งหมายของการศึกษาปัจจุบันคือ รหัสอย่างรวดเร็ว และแม่นยำของโรคสายพันธุ์ที่แยกต่างหากจากเล็บติดเชื้อ โดยใช้เทคนิค PCR-RFLPวัสดุและวิธีการ:จำนวน 360 ยีสต์คลินิกถูกเก็บรวบรวมจากเชื้อเล็บในอิหร่าน Genomic DNA ถูกสกัดโดยใช้เขตการค้าเสรี บัตร ITS1-5.8SrDNA-ITS2 ภูมิภาคถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากล และต่อผลิตภัณฑ์ถูกย่อย ด้วยเอนไซม์จำกัด MspI สำหรับการระบุอธิบายใหม่พันธุ์ (C. parapsilosis คอมเพล็กซ์), ยีน SADH ถูกขยาย ตามด้วย Nla III จำกัดเอนไซม์ที่ย่อยอาหารผลลัพธ์:Candida albicans มักแยกสายพันธุ์ (41.1%), ตาม ด้วยซี parapsilosis (21.4%), C. tropicalis (12.8%), C. kefyr (9.4%), C. krusei (5.5%), C. orthopsilosis (4.1%), C. ไข่ (2.8%), C. guilliermondii (1.4%), C. งูเหนือ (0.8%), และ C. lusitaniae (0.5%) ได้ ผู้ป่วยในกลุ่มอายุ 51-60 และ 81-90 ปีมีการกระจายสูงสุด และต่ำสุดของ specimens บวก ตามลำดับสรุป:รหัสอย่างรวดเร็ว และแม่นยำพันธุ์ Candida จาก specimens คลินิกทำให้แผนการรักษาที่เหมาะสมคำสำคัญ: โรคพันธุ์ onychomycosis, PCR-RFLPแนะนำใส่ทั้งหมดติดเชื้อราของเล็บจาก filamentous Onychomycosis และ yeast เชื้อรา การลงบัญชีสำหรับโรคเล็บถึง 50% ของทั้งหมดที่ตั้งแต่กระดูก และด้านข้าง subungual ผิวเผิน proximal subungual และ dystrophic onychomycosis อย่างไรก็ตาม ในโฮสต์ภูมิคุ้มกันสามารถนำเสนอปัญหาสุขภาพยิ่งขึ้น การศึกษา [1,2] ได้แสดงว่า ส่วน onychomycosis ที่เพิ่มขึ้นกับอายุ และสาเหตุเพิ่มที่เกี่ยวข้องกับอายุใน onychomycosis อาจประกอบด้วยขาดสาร circumferential หมุนเวียน บาดเจ็บเล็บซ้ำ เปิดรับแสงนานกว่า pathogenic เชื้อรา โรคเบาหวาน ความผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกัน incompetence ไปตัด toenails ให้พิจารณาเท้าดี [3,4] Moreover ปัจจัยจำนวนมากมีอยู่สำหรับเพิ่มส่วน onychomycosis ในชีวิตสมัยใหม่เช่นการสวมใส่รองเท้าโดยเฉพาะส้นสูงรองเท้า พื้นที่ความชื้นสูง (โรงยิมและนอนมวยปล้ำ โดยจำนวนคนมาก) การใช้ยาปฏิชีวนะ broad-spectrum และการรักษาด้วย corticosteroid [5] แม้ว่าพันธุ์ dermatophyte ทำให้ 90% ของ toenails onychomycosis แคนชนิดจะถือว่าเป็นหนึ่งในสาเหตุสำคัญที่สุดของเล็บมือนาง onychomycosis [6,7] candida albicans มีเล็บติดเชื้อสายพันธุ์แพร่หลายมากที่สุดที่สามารถทำให้เกิดโรค และ invades แผ่นเล็บทั้งหมด แต่ onycholysis และ paronychia อาจเกิดขึ้น [7] ในกรณีที่เล็บติดเชื้อ Candida ความถูกต้องของสาเหตุการที่ระดับสปีชีส์มีอำนาจสำคัญเนื่องจากการพัฒนาอย่างรวดเร็วของความต้านทานบางชนิดกับยาต้านเชื้อรา เช่น C. krusei เป็น innately ทนต่อ fluconazole และเซลเซียสไข่จะสามารถจะทน [8] ดังนั้น เนื่องจากระดับสูงของคล้ายไทป์ระหว่างพันธุ์ Candida ระบุปัญหาได้แน่ แนวทางทั่วไปสำหรับรหัสจนถึงระดับชนิดในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยตามเกณฑ์สัณฐาน และสรีรวิทยา ต้องหลายวันหรือสัปดาห์สรุปได้ และ unspecific บ่อย อย่างไรก็ตาม วันนี้วิธีรหัสโมเลกุลได้ดีขึ้น เช่น จำกัดแยกส่วนความยาว polymorphisms (RFLP), RFLP hybridization คลิปปากตะเข้ วิเคราะห์ดีเอ็นเอ (อาร์เอพีดี) polymorphic เอาต์แบบสุ่ม karyotyping ด้วย และจัดลำดับ วิธีหลังจะค่อนข้างแพง, [9] ดังนั้น เครื่องมือระดับโมเลกุลอื่น มี specificity, reproducibility ความระมัดระวังเพียงพอเป็นสิ่งจำเป็น [9,10] ดังนั้น ในการศึกษาปัจจุบัน เราใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ขยายที่ทั้งหมดภายในทับเป็นตัวเว้นวรรค (ของ) -rDNA ภูมิภาคและแอลกอฮอล์รองยีน dehydrogenase (SADH) ตาม ด้วยการวิเคราะห์ RFLP สำหรับการระบุชนิดของโรคที่ได้รับจาก onychomycosisวัสดุและวิธีการสายพันธุ์เชื้อราจำนวน 360 ยีสต์คลินิกได้รับมาจากเล็บติดเชื้อของผู้ป่วยที่เตหราน อิสฟาฮาน Alborz, Kashan และ Mazandaran จังหวัดของอิหร่าน เมษายน 2552 ถึง 2554 มิถุนายน สายพันธุ์ทั้งหมดมีอ่างใน sabouraud agar กลูโคส (Difco ดีทรอยต์ MI สหรัฐอเมริกา) และ incubated สำหรับ 48 h ที่ 28-30° C Loopful ของอาณานิคมเดี่ยว และสดของแต่ละต้องใช้ถูกโอนย้ายไปกลีเซอร 20% และเก็บไว้ที่ –20 ° C ก่อนนำไปใช้สกัดดีเอ็นเอและขยายขอบเขตของ rDNAGenomic DNA ถูกสกัดโดยใช้เขตการค้าเสรี® Elute ไมโครการ์ด (Whatman Inc. คลิฟตั้น NJ สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต [11] โดยย่อ อาณานิคมสดถูกระงับใน μl 100 กระบอกน้ำ แล้ว μl ที่ 4 ของการระงับมี dribbled บนดิสก์ของเขตการค้าเสรี (3 mm เส้นผ่านศูนย์กลาง), บัตรต่อ incubated ที่อุณหภูมิห้องอย่างน้อย 3 ชั่วโมง กระดาษแห้งถูก eluted 500 μl กลั่นน้ำกี่วินาที เขตการค้าเสรีบัตรถูกถ่ายโอนไปหลอดใหม่ μl 30 ที่มีน้ำกลั่น และ incubated 25 นาทีที่ 95° C ดิสก์กระดาษได้ดำเนินการไปในที่สุด และมีเก็บน้ำที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอที่ –20 องศาเซลเซียส เป็นตัวเว้นวรรคทับภายในภูมิภาค (ITS1-5.8SrDNA-ITS2) ภูมิภาคถูกขยายโดย ITS1 สองสากล (G 5Ͳ-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3Ͳ) และ ITS4 (TATTGATATGC GCT 5Ͳ-TCCTCC-3Ͳ) ไพรเมอร์ [12] ปฏิกิริยา PCR ดำเนินในการยีน Amp PCR ระบบ 9700 (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ในไดรฟ์ μl 25 ประกอบด้วย 25 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา μl 2.5 (0.1 M ทริสเรทติ้ง HCl, pH 8.0, 0.5 M KCl, MgCl2, 0.1% gelatine, 15 มม. 1% ไตรตั้น X 100), 0.1 มม.แต่ละ dNTP และ 1.0 U Taq DNA พอลิเมอเรส ทำการขยาย ด้วยวงจร 2 นาทีที่ 94° C สำหรับ denaturation หลัก ตามรอบ 35 ที่ 95° C (30 s), 55° C (45 s) และ 72° C (60 s), ขั้นตอนการขยาย 7 นาทีสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดดีเอ็นเอและการขยายของภูมิภาค ITS rDNA
วิจัยขั้นสูงชีวการแพทย์
Medknow
สิ่งพิมพ์การใช้ความแตกต่างความยาวส่วนข้อจำกัด ในการระบุสายพันธุ์ Candida ที่เกี่ยวข้องกับ Onychomycosis Rasoul มูฮัมมาดี, Parisa Badiee [... ] และ Farnaz Heshmat ข้อมูลเพิ่มเติมบทความบทคัดย่อพื้นหลัง: Onychomycosis เป็นหนึ่งในรูปแบบทางคลินิกพบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อราเนื่องจากทั้งเชื้อราและยีสต์ ประเภท Candida เป็นหนึ่งในสาเหตุที่โดดเด่นที่สุดของ Onychomycosis ในทั่วทุกมุมโลก แม้ว่า Candida albicans ยังคงเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อเล็บ, การใช้สารต้านเชื้อราในวงกว้างสเปกตรัมได้นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในสาเหตุของ albicans ซีที่จะไม่ใช่สายพันธุ์ albicans จุดมุ่งหมายของการศึกษาในปัจจุบันเป็นไปอย่างรวดเร็วและบัตรประจำตัวที่ถูกต้องของสายพันธุ์เชื้อราแคนดิดาที่แยกจากการติดเชื้อเล็บโดยใช้เทคนิค PCR-RFLP. วัสดุและวิธีการ: รวม 360 สายพันธุ์ยีสต์ทางคลินิกที่ถูกเก็บรวบรวมจากการติดเชื้อเล็บในอิหร่าน ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้เอฟทีเอการ์ด ภูมิภาค ITS1-5.8SrDNA-ITS2 ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากลและผลิตภัณฑ์ที่ต่อมาได้รับการย่อยด้วยเอนไซม์ข้อ จำกัด MspI เพื่อระบุตัวตนของสายพันธุ์ใหม่ที่อธิบาย (C. parapsilosis ซับซ้อน) ยีน SADH ที่ถูกขยายตามด้วยการย่อยด้วยเอนไซม์ จำกัด Nla III. ผลการศึกษา: เชื้อ Candida albicans เป็นสายพันธุ์ที่แยกกันทั่วไป (41.1%) ตามมาด้วยซี parapsilosis (21.4 %) tropicalis C. (12.8%) ซี kefyr (9.4%) C. krusei (5.5%) ซี orthopsilosis (4.1%) C. glabrata (2.8%) ซี guilliermondii (1.4%) ซี rugosa (0.8%) และซี lusitaniae (0.5%) ผู้ป่วยในกลุ่มอายุ 51-60 ปีและ 81-90 มีการกระจายสูงสุดและต่ำสุดของตัวอย่างที่เป็นบวกตามลำดับ. สรุป: การระบุอย่างรวดเร็วและแม่นยำของสายพันธุ์ Candida จากตัวอย่างทางคลินิกที่นำไปสู่การรักษาที่เหมาะสมแผน. คำสำคัญ: สายพันธุ์ Candida, Onychomycosis , PCR-RFLP บทนำOnychomycosis ล้อมรอบติดเชื้อราทั้งหมดของเล็บเนื่องจากเชื้อราและยีสต์คิดเป็นถึง 50% ของความผิดปกติของเล็บซึ่งตั้งแต่ปลาย subungual และด้านข้างตื้นใกล้เคียง subungual และ dystrophic Onychomycosis; อย่างไรก็ตามในโฮสต์ภูมิคุ้มกันสามารถนำเสนอปัญหาสุขภาพสำคัญมากขึ้น. [1,2] การศึกษาพบว่าความชุกของการเพิ่มขึ้นของ Onychomycosis กับอายุและเหตุผลสำหรับการเพิ่มขึ้นที่เกี่ยวข้องกับอายุใน Onychomycosis อาจจะมีการไหลเวียนของเส้นรอบวงขาดซ้ำบาดเจ็บเล็บอีกต่อไป การสัมผัสกับเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคเบาหวานโรคความผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายไร้ความสามารถที่จะตัดเล็บเท้าหรือเท้าให้การพิจารณาที่ดี. [3,4] นอกจากนี้ยังมีหลายปัจจัยที่มีอยู่สำหรับการเพิ่มความชุกของ Onychomycosis ในชีวิตที่ทันสมัยเช่นการสวมใส่รองเท้าสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่ง รองเท้าส้นพื้นที่ที่มีความชื้นสูง (โรงยิมและที่นอนมวยปล้ำโดยตัวเลขที่ดีของคน) การใช้ยาปฏิชีวนะในวงกว้างสเปกตรัมและการรักษาด้วย corticosteroid. [5] แม้ว่า dermatophyte ชนิดก่อให้เกิด 90% ของเล็บเท้า Onychomycosis, พันธุ์ Candida เป็นที่ยอมรับว่าเป็นหนึ่งใน สาเหตุที่สำคัญที่สุดของเล็บมือ Onychomycosis. [6,7] Candida albicans เป็นสายพันธุ์ที่แพร่หลายมากที่สุดที่สามารถทำให้เกิดการติดเชื้อ Candida เล็บและก้าวก่ายแผ่นเล็บทั้งหมด แต่ onycholysis และ paronychia อาจเกิดขึ้น. [7] ในกรณีที่มีการติดเชื้อ Candida เล็บที่ ประชาชนที่ถูกต้องของเจ้าหน้าที่ในระดับที่ก่อให้เกิดสายพันธุ์ที่มีความสำคัญอย่างมากเนื่องจากการพัฒนาอย่างรวดเร็วของความต้านทานของบางชนิดยาเสพติดเชื้อราเช่น C. krusei ทนกำเนิดเพื่อ fluconazole และ C. glabrata สามารถจะทน. [8] ดังนั้น เนื่องจากระดับสูงของความคล้ายคลึงกันระหว่างฟีโนไทป์สายพันธุ์ Candida ปัญหาบัตรประจำตัวที่มีกำลังใกล้เข้ามา วิธีธรรมดาสำหรับการระบุลงไปถึงระดับสายพันธุ์ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยจะขึ้นอยู่กับเกณฑ์ที่ทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยาต้องหลายวันหรือหลายสัปดาห์ที่ผ่านมาจะได้ข้อสรุปและมักจะเป็น unspecific แต่วันนี้วิธีการระบุโมเลกุลจะดีขึ้นเช่นชิ้นส่วนข้อ จำกัด ระยะเวลาในความหลากหลาย (RFLP) RFLP กับโพรบพันธุ์ดีเอ็นเอขยายสุ่ม polymorphic (RAPD) วิเคราะห์ karyotyping electrophoretic และลำดับ วิธีหลังมีราคาแพงค่อนข้าง [9] ดังนั้นเครื่องมือโมเลกุลทางเลือกที่มีความจำเพาะที่เพียงพอในการทำซ้ำและความไวเป็นสิ่งที่จำเป็น. [9,10] ดังนั้นในการศึกษาปัจจุบันเราใช้วิธี polymerase chain reaction (PCR) เพื่อขยายทั้งภายใน คัดลอก spacer (ITS) -rDNA ภูมิภาคและ dehydrogenase แอลกอฮอล์รอง (SADH) ยีนตามด้วยการวิเคราะห์ RFLP เพื่อระบุตัวตนของสายพันธุ์ Candida ที่ได้รับจาก Onychomycosis. วัสดุและวิธีการเชื้อราสายพันธุ์รวม360 สายพันธุ์ยีสต์ทางคลินิกที่ได้รับจากการติดเชื้อเล็บของผู้ป่วย ที่กรุงเตหะรานอิสฟาฮัน Alborz, ชานและจังหวัด Mazandaran อิหร่านตั้งแต่เดือนเมษายน 2009 ถึงเดือนมิถุนายน 2011 สายพันธุ์ทั้งหมดถูกเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ SABOURAUD กลูโคส (Difco, ดีทรอยต์, มิชิแกนสหรัฐอเมริกา) และบ่มที่ 28-30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง . loopful อาณานิคมเดียวและความสดใหม่ของแต่ละสายพันธุ์ก็ถูกย้ายไปกลีเซอรีน 20% และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสก่อนที่จะใช้. สกัดดีเอ็นเอและการขยายของภูมิภาค ITS rDNA ดีเอ็นเอจีโนมถูกสกัดโดยใช้FTA®ชะไมโครการ์ด (เบอร์อิงค์ คลิฟตัน, นิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต. [11] สั้น ๆ , อาณานิคมสดถูกระงับใน 100 ไมโครลิตรของน้ำหมันแล้ว 4 ไมโครลิตรของการระงับได้ไหลลงบนแผ่นดิสก์บัตรเขตการค้าเสรี (ที่ 3 มม) ต่อมาบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาอย่างน้อย 3 ชั่วโมง เอกสารแห้งชะใน 500 ไมโครลิตรน้ำกลั่นไม่กี่วินาที บัตรเอฟทีเอที่ถูกย้ายไปเป็นหลอดใหม่ที่มี 30 ไมโครลิตรน้ำกลั่นและบ่มที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 25 นาที ในที่สุดแผ่นกระดาษถูกนำออกไปและน้ำที่มีดีเอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C ภูมิภาค spacer คัดลอกภายใน (ITS1-5.8SrDNA-ITS2) ภูมิภาคได้รับการขยายโดยใช้สอง ITS1 สากล (5Ͳ TCCGTAGGTGAACCTGCG-G-3Ͳ) และ ITS4 (5Ͳ-TCCTCC GCT TATTGATATGC-3Ͳ) ไพรเมอร์. [12] ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการเกี่ยวกับ ระบบแอมป์ยีน PCR 9700 (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) 25 ไมโครลิตรปริมาณที่มี 25 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 2.5 ไมโครลิตร (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 M KCl 15 มิลลิ MgCl2, 0.1% เจลาติน, 1% Triton X-100) 0.1 มิลลิของแต่ละ dNTP และ 1.0 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ ขยายได้ดำเนินการกับรอบ 2 นาทีที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา denaturation หลักตามด้วย 35 รอบที่ 95 ° C (30 s), 55 ° C (45 s) และ 72 ° C (60 s) ด้วยสุดท้าย 7 นาที ขั้นตอนการขยายที่ 72 ° C

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอและเพิ่มปริมาณของ rDNA ภูมิภาค
ขั้นสูงการวิจัยทางการแพทย์

ใช้ medknow สิ่งพิมพ์จำกัด fragment length polymorphism ระบุเชื้อราชนิดที่เกี่ยวข้องกับเจ็บไข้ได้ป่วย

rasoul mohammadi ปริษา badiee , , [ . . . ] และ farnaz heshmat ข้อมูลเพิ่มเติม





บทความบทคัดย่อพื้นหลัง :เจ็บไข้ได้ป่วยเป็นหนึ่งในรูปแบบที่พบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อราคลินิก เนื่องจากทั้งคู่เป็นเชื้อราและยีสต์ ชนิดของเชื้อราเป็นหนึ่งในสาเหตุที่โดดเด่นที่สุดของเจ็บไข้ได้ป่วยในทั่วโลก แม้ว่า Candida albicans ยังเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อเล็บเชื้อราการใช้ตัวแทนเหล่านี้ได้นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในสาเหตุของไม่ไม่ไม่ชนิด จุดมุ่งหมายของการศึกษาคืออย่างรวดเร็วและแม่นยำกำหนดสายพันธุ์ที่แยกได้จากการติดเชื้อ Candida เล็บโดยใช้เทคนิคว่า .
วัสดุและวิธีการ :

รวม 360 ยีสต์สายพันธุ์ทางคลินิกได้รวบรวมจากการติดเชื้อเล็บในอิหร่าน จีโนมดีเอ็นเอ โดยใช้ FTA ;บัตร its1-5 .8srdna-its2 ภูมิภาคขยายใช้ไพรเมอร์ที่สากลและต่อมาผลิตภัณฑ์ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ โดยใช้ . สำหรับการอธิบายชนิดใหม่ ( C . parapsilosis ซับซ้อน ) , sadh ยีนถูกขยายตามด้วย การย่อยด้วยเอนไซม์จาก สนช. 3 .
:

Candida albicans เป็นมักแยกชนิด ( 41.1 % ) รองลงมาคือ ซี. parapsilosis ( 21.4% )C . tropicalis มีผลต่อ ( 12.8 % ) , C . kefyr ( 9.4% ) , C . 90 ( 5.5 ) , C . orthopsilosis ( 4.1% ) , C . flava ( 2.8% ) , C . guilliermondii ( 1.4% ) , C . พัฒนา ( 0.8% ) และ C . lusitaniae ( 0.5% ) ผู้ป่วยในกลุ่มอายุ 51-60 ปีมี 81-90 และการแจกแจงของตัวอย่างสูงสุดและต่ำสุด บวก


สรุปตามลำดับรวดเร็วและแม่นยำการแคนดิดาชนิดจากตัวอย่างทางคลินิกนำแผนการรักษาที่เหมาะสม .
คำสำคัญ : แคนดิดาชนิด เจ็บไข้ได้ป่วยเบื้องต้นว่า
,

เจ็บไข้ได้ป่วยแนบทั้งหมดการติดเชื้อราของเล็บ เนื่องจากเป็น ยีสต์และเชื้อรา เป็นสัดส่วนถึง 50% ของความผิดปกติของเล็บ ซึ่งตั้งแต่ปลายและด้านข้าง subungual , ผิวเผิน ,การทำงานและ subungual ดิสโทรฟิคเจ็บไข้ได้ป่วย ; อย่างไรก็ตาม , ภูมิคุ้มกันบกพร่องโยธาสามารถเสนอปัญหาสุขภาพมากขึ้น [ 2 ] จากการศึกษาพบว่า ความชุกของการเพิ่มเจ็บไข้ได้ป่วย ด้วยอายุและเหตุผลสำหรับจุดเพิ่มเจ็บไข้ได้ป่วยอาจจะมีการเวียนซ้ำแผลแฉะ , เล็บ , แสงอีกต่อไป เชื้อโรค เชื้อรา โรคเบาหวานความผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกัน การไร้ความสามารถที่จะตัดเล็บเท้าให้พิจารณา [ 4 ] นอกจากนี้ ปัจจัยมากมายที่มีอยู่เพื่อเพิ่มความเจ็บไข้ได้ป่วยในชีวิตที่ทันสมัย เช่น การสวมใส่รองเท้าโดยเฉพาะ รองเท้าส้นสูง , พื้นที่ความชื้นสูง ( โรงยิมและที่นอนมวยปล้ำโดยตัวเลขที่ดีของคน ) การใช้สเปกตรัมยาปฏิชีวนะแล้วเฟิร์นราชินี [ 5 ] แม้ว่าเดอมาโตไฟต์สายพันธุ์ เพราะ 90% ของเล็บเท้าเจ็บไข้ได้ป่วย Candida สายพันธุ์ถือเป็นหนึ่งในสาเหตุสำคัญของการรักษาโรคเชื้อราที่เล็บมือต่อไป [ 6 , 7 ] Candida albicans เป็นที่แพร่หลายมากที่สุดชนิดที่สามารถทำให้เกิดเชื้อ Candida เล็บและแพร่กระจายไปยังแผ่นเล็บทั้งหมด แต่ paronychia Onycholysis และอาจเกิดขึ้น[ 7 ] ในกรณีของเล็บเชื้อ Candida ระบุความถูกต้องของตัวแทนที่เป็นสาเหตุที่สายพันธุ์ระดับสำคัญ เนื่องจากการพัฒนาอย่างรวดเร็วของความต้านทานต่อยาต้านเชื้อราบางชนิด เช่น ซี 90 มีโดยกำเนิดทนต่อยา และ C . flava สามารถทน . [ 8 ] ดังนั้น เนื่องจากระดับ สูงของความคล้ายคลึงกันระหว่างเชื้อของเซลล์ชนิดปัญหากำลังจะเกิดขึ้น แนวทางทั่วไปสำหรับการระบุลงไปในระดับห้องปฏิบัติการ การวินิจฉัยชนิดตามลักษณะทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยา เกณฑ์ ต้องหลายวันหรือสัปดาห์ เพื่อสรุป และมัก unspecific . อย่างไรก็ตาม วันนี้มีวิธีการสร้างโมเลกุลชนิดดี เช่น การจำกัดขนาดความยาวล ( RFLP )รวมกับ hybridization probes , สุ่ม amplified polymorphic DNA ( RAPD ) การวิเคราะห์ รูปแบบโครโมโซมและ , ของ วิธีหลังจะค่อนข้างแพง [ 9 ] ดังนั้น ทางเลือกของเครื่องมือที่มีโมเลกุลความจำเพาะเพียงพอและความไวของยาจำเป็น [ 9,10 ] ดังนั้นในการศึกษาปัจจุบันเราใช้วิธีพีซีอาร์ ( PCR ) เพื่อขยายทั้งภายในและ spacer ( ITS ) และระดับภูมิภาคด้วยยาถ่าย ( sadh ยีนตามด้วยการวิเคราะห์ RFLP ในการจำแนกชนิดของเชื้อราสายพันธุ์ที่ได้มาจากวัสดุและวิธีการเจ็บไข้ได้ป่วย .

เชื้อราสายพันธุ์

รวม 360 ยีสต์สายพันธุ์ทางคลินิกได้จากเล็บ เชื้อของผู้ป่วยใน Isfahan , เตหะรานลโบร์ซ Kashan , และ Markazi จังหวัดอิหร่าน เมษายน 2552 ถึง มิถุนายน 2554 ทุกสายพันธุ์ที่เพาะเลี้ยงบนอาหารวุ้นตาล sabouraud ( difco ดีทรอยต์ , มิชิแกน , สหรัฐอเมริกา ) และบ่มที่อุณหภูมิ 28-30 องศา C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เป็น loopful เดี่ยวและอาณานิคมใหม่ของแต่ละสายพันธุ์ถูกย้ายไปโต 20% และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C ) ก่อนที่จะใช้
การสกัดดีเอ็นเอและขยายของภูมิภาค
ของ rDNA
จีโนมดีเอ็นเอ โดยใช้ FTA ® elute ไมโครการ์ด ( whatman อิงค์ , คลิฟตัน , NJ , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต [ 11 ] สั้นอาณานิคมใหม่ถูกระงับในμ 100 ลิตรน้ำหมันแล้ว 4 μลิตรถูกระงับ dribbled บนแผ่นดิสก์ FTA card ( 3 มม. ) ต่อมา บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาอย่างน้อย 3 ชั่วโมงเอกสารตัวอย่างแห้งอยู่ใน 500 μผมน้ำกลั่นไม่กี่วินาที FTA card ถูกส่งไปใหม่หลอดบรรจุ 30 μผมน้ำกลั่นและบ่มที่อุณหภูมิ 95 องศา C ประมาณ 25 นาที กระดาษแผ่นสุดท้ายถูกจับตัวไป และน้ำที่มีดีเอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศา ภายในภูมิภาคและ spacer ( its1-5 .8srdna-its2 ) ภูมิภาคขยายโดยใช้สองสากล its1 ( 5 Ͳ - tccgtaggtgaacctgcg 3 Ͳ ) และ its4 ( 5 Ͳ - tcctcc GCT tattgatatgc-3 Ͳ ) ไพรเมอร์ [ 12 ] ปฏิกิริยา PCR จำนวนยีน PCR ) ระบบ 9700 ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย ) ใน 25 μ L ปริมาณบรรจุ 25 นาโนดีเอ็นเอ แม่แบบ , 2.5 μ L ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ ( 0.1 M HCl ซึ่ง pH 8.0 , 0.5 M KCl 15 มม. ชุดเจลาติน , 0.1% ,1% Triton X-100 ) , 0.1 มิลลิเมตรของแต่ละ dntp และ 1.0 วูทัค DNA polymerase . มีการขยายรอบ 2 นาทีที่ 94 ° C ( หลัก ตามด้วย 35 รอบที่ 95 องศา C ( 30 ) 55 ° C ( 45 ) และ 72 ° C ( 60 ) มี 7 ขั้นตอนสุดท้ายมินส่วนขยายที่ 72 องศา