Site-specific gene addition can all

Site-specific gene addition can allow stable transgene expression for gene therapy. When possible, this is preferred over the use of promiscuously integrating vectors, which are sometimes associated with clonal expansion and oncogenesis. Site-specific endonucleases that can induce high rates of targeted genome editing are finding increasing applications in biological discovery and gene therapy. However, two safety concerns persist: endonuclease-associated adverse effects, both on-target and off-target; and oncogene activation caused by promoter integration, even without nucleases. Here we perform recombinant adeno-associated virus (rAAV)-mediated promoterless gene targeting without nucleases and demonstrate amelioration of the bleeding diathesis in haemophilia B mice. In particular, we target a promoterless human coagulation factor IX (F9) gene to the liver-expressed mouse albumin (Alb) locus. F9 is targeted, along with a preceding 2A-peptide coding sequence, to be integrated just upstream to the Alb stop codon. While F9 is fused to Alb at the DNA and RNA levels, two separate proteins are synthesized by way of ribosomal skipping. Thus, F9 expression is linked to robust hepatic albumin expression without disrupting it. We injected an AAV8-F9 vector into neonatal and adult mice and achieved on-target integration into ∼0.5% of the albumin alleles in hepatocytes. We established that F9 was produced only from on-target integration, and ribosomal skipping was highly efficient. Stable F9 plasma levels at 7-20% of normal were obtained, and treated F9-deficient mice had normal coagulation times. In conclusion, transgene integration as a 2A-fusion to a highly expressed endogenous gene may obviate the requirement for nucleases and/or vector-borne promoters. This method may allow for safe and efficacious gene targeting in both infants and adults by greatly diminishing off-target effects while still providing therapeutic levels of expression from integration.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นอกจากนี้ยีนเฉพาะสามารถนิพจน์ transgene ที่มั่นคงสำหรับยีนบำบัด เมื่อเป็นไปได้ นี้ได้ต้องผ่านการใช้การรวมเวกเตอร์ ที่บางครั้งเกี่ยวข้องกับการขยาย clonal และ oncogenesis promiscuously Endonucleases เฉพาะที่สามารถก่อให้เกิดอัตราสูงแก้ไขกลุ่มเป้าหมายกำลังค้นหาโปรแกรมประยุกต์เพิ่มขึ้นในการค้นพบและยีนบำบัดทางชีวภาพ อย่างไรก็ตาม การคงอยู่ของความกังวลด้านความปลอดภัยสอง: สัมพันธ์ endonuclease กระทบ บนเป้าหมายและปิดเป้าหมาย และเปิดใช้งาน oncogene ที่เกิดจากการรวมโปรโมเตอร์ แม้ไม่มี nucleases ที่นี่เราทำไวรัสสแตน recombinant adeno สัมพันธ์ (rAAV) -mediated promoterless ยีนเป้าหมาย โดย nucleases และแสดงให้เห็นถึง amelioration ของ diathesis มีเลือดออกในหนูโรคฮีโมฟิเลียบี โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เรากำหนดเป้าหมายยีน IX (F9) ปัจจัยการแข็งตัวของเลือดมนุษย์ promoterless ไปเมาส์แสดงตับ albumin (Alb) โลกัสโพล F9 มีเป้าหมาย พร้อมกับการก่อนหน้าเพปไทด์ 2A รหัสลำดับ จะรวมเพียงต้นน้ำกับรหัสพันธุกรรมหยุด Alb ในขณะที่ F9 เป็น fused เพื่อ Alb ในระดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ โปรตีนที่แยกต่างหากสองสังเคราะห์โดยวิธีข้าม ribosomal ดังนั้น F9 นิพจน์ถูกลิงค์ไปนิพจน์ albumin ตับแข็งแกร่ง โดยควบมัน เราฉีดเป็นเวกเตอร์ AAV8 F9 เป็นทารกแรกเกิด และผู้ใหญ่หนู และประสบความสำเร็จในเป้าหมายรวมเป็น ∼0.5% ของ alleles albumin ใน hepatocytes เราก่อตั้ง F9 มีผลิตเฉพาะจากบนเป้าหมายรวม และข้าม ribosomal มีประสิทธิภาพสูง ได้รับระดับพลาสมา F9 มั่นคง 7-20% ของปกติ และบำบัดหนู F9-ไม่มีเวลาปกติเลือดแข็งตัว เบียดเบียน รวม transgene เป็นฟิวชั่น 2A จะเป็นยีน endogenous สูงแสดงอาจ obviate ข้อกำหนดสำหรับ nucleases หรือแบกรับเวกเตอร์ก่อ วิธีนี้อาจทำให้เซฟ และบ็อชยีนเป้าหมายในทารกและผู้ใหญ่โดยมากลดลงผลจากเป้าหมายในขณะที่ยังคง ให้รักษาระดับของนิพจน์จากรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

นอกจากนี้ยีนเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงสามารถอนุญาตให้แสดงออกของยีนที่มั่นคงสำหรับการรักษาด้วยยีน เมื่อเป็นไปได้นี้เป็นที่ต้องการมากกว่าการใช้การบูรณาการ promiscuously เวกเตอร์ซึ่งบางครั้งจะเกี่ยวข้องกับการขยายตัว clonal และเกิดเนื้องอก endonucleases เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงที่สามารถก่อให้เกิดอัตราที่สูงของการแก้ไขจีโนมการกำหนดเป้​​าหมายที่กำลังมองหาการใช้งานที่เพิ่มขึ้นในการค้นพบทางชีวภาพและการรักษาด้วยยีน อย่างไรก็ตามความกังวลเรื่องความปลอดภัยยังคงมีอยู่สอง: endonuclease ที่เกี่ยวข้องผลกระทบทั้งในและนอกเป้าหมายเป้าหมาย; และอองโคยีนยืนยันการใช้งานที่เกิดจากการรวมกลุ่มผู้ก่อการได้โดยไม่ต้องนิ ที่นี่เราดำเนินการ recombinant ไวรัส adeno ที่เกี่ยวข้อง (rAAV) -mediated กำหนดเป้​​าหมายยีน promoterless โดยไม่ต้องแสดงให้เห็นถึงนิและเยียวยาของ diathesis เลือดออกในฮีโมฟีเลียหนู B โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่เรากำหนดเป้​​าหมายเป็นปัจจัยการแข็งตัวของมนุษย์ promoterless ทรงเครื่อง (F9) ยีนไปยังอัลบูมิเมาส์ตับแสดง (Alb) สถานที่ F9 เป็นเป้าหมายพร้อมกับก่อนหน้า 2A-เปปไทด์ลำดับการเข้ารหัสที่จะบูรณาการเพียงต้นน้ำที่จะหยุด codon Alb ในขณะที่ F9 ผสมเพื่อ Alb ในระดับ DNA และ RNA สองโปรตีนที่แยกจากกันมีการสังเคราะห์โดยวิธีการข้ามโซมอล ดังนั้นการแสดงออก F9 จะเชื่อมโยงกับการแสดงออกของโปรตีนชนิดหนึ่งที่มีประสิทธิภาพตับโดยไม่กระทบกับมัน เราฉีดเวกเตอร์ AAV8-F9 ลงในทารกแรกเกิดและหนูผู้ใหญ่และประสบความสำเร็จในการรวมกลุ่มในเป้าหมายเข้า ~0.5% ของอัลลีลอัลบูมิในเซลล์ตับ เรายอมรับว่า F9 ถูกผลิตจากการบูรณาการในเป้าหมายและข้ามโซมอลเป็นที่มีประสิทธิภาพสูง ระดับพลาสมา F9 คงที่ 7-20% ของปกติท​​ี่ได้รับและได้รับการรักษาหนู F9 ขาดได้ครั้งแข็งตัวปกติ สรุปได้ว่าการรวมยีนเป็น 2A ฟิวชั่นที่จะแสดงความสูงของยีนภายนอกอาจลบล้างความต้องการสำหรับนิและ / หรือผู้สนับสนุนแมลงเป็นพาหะ วิธีนี้อาจจะอนุญาตให้มีการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพกำหนดเป้​​าหมายในทารกและผู้ใหญ่อย่างมากโดยลดลงผลกระทบนอกเป้าหมายในขณะที่ยังคงให้การรักษาระดับของการแสดงออกจากการรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นอกจากนี้ยีนที่เฉพาะเจาะจงเว็บไซต์สามารถอนุญาตให้มีการแสดงออกยีนยีนบำบัด เมื่อเป็นไปได้ นี้เป็นที่ต้องการมากกว่าการรวมเวกเตอร์ที่ไม่มีจุดประสงค์ ซึ่งบางครั้งเกี่ยวข้องกับการขยายงาน และ นโคเจเนซิส . เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงสงบเงียบที่ทำให้เกิดอัตราสูงของเป้าหมายการเพิ่มการค้นหาจีโนมในการค้นพบทางชีววิทยาและยีนบำบัดอย่างไรก็ตาม ความกังวลด้านความปลอดภัยที่เกี่ยวข้อง : เอนโดนิวคลีเอสสองยังคงมีผลกระทบทั้งเป้าหมายและเป้าหมาย และการกระตุ้นที่เกิดจากการบูรณาการงโคยีน promoter , โดยไม่ต้อง nucleases . ที่นี่เราแสดงแนนท์สัมพันธ์ - Adeno ไวรัส ( raav ) - ( promoterless ยีนเป้าหมายโดยไม่ nucleases และแสดงให้เห็นถึงการแก้ปัญหาของเลือด diathesis ) ฮีโมฟิเลีย บี โดยเฉพาะอย่างยิ่งเราเป็นมนุษย์ที่มีเป้าหมาย promoterless ปัจจัย 9 ( F9 ) ยีนกับตับแสดงอัลบูมินเมาส์ ( Alb ) - . F9 เป็นเป้าหมาย พร้อมกับก่อนหน้านี้ 2A เปปไทด์ลำดับนะครับ จะรวมแค่ต้นกับขาวรหัสหยุด ในขณะที่ F9 ประกอบกับขาวใน DNA และ RNA ระดับสองแยกโปรตีนที่สังเคราะห์โดยวิธีของไรโบโซมข้าม ดังนั้นการแสดงออก F9 เชื่อมโยงที่แข็งแกร่งเอนไซม์อัลบูมินการแสดงออกโดยไม่ขัดขวางมัน เราฉีดเวกเตอร์ aav8-f9 ในทารกแรกเกิด และผู้ใหญ่ หนู และได้บูรณาการเป้าหมายใน∼ 0.5% ของอัลบูมินในในเซลล์ตับ . เราก่อตั้งขึ้นที่ถูกผลิตจาก F9 ในการบูรณาการเป้าหมายและไรโบโซมอล ข้าม คือ มีประสิทธิภาพสูงมั่นคง F9 พลาสมาระดับ 7-20 บาทปกติได้ และถือว่าขาดหนูมีเวลาตกตะกอน F9 ปกติ สรุป ยีนการรวมกลุ่มเป็นฟิวชั่น 2A ให้สูงแสดงภายในยีนอาจปัดเป่าความต้องการ nucleases และ / หรือเวกเตอร์แบกโปร .วิธีนี้อาจช่วยให้ปลอดภัยและได้ผลชะงัดยีนเป้าหมายทั้งในทารกและผู้ใหญ่ โดยมากลดลงจากผลเป้าหมายในขณะที่ยังคงให้ระดับยาในการแสดงออกจากการรวม