MethodsSample collectionThis study

Methods

Sample collection

This study included 86 field archival isolates of C. suis
from years 2011–2013, which were derived from clinically
healthy animals and pigs with clinical disorders (i.e.
conjunctivitis cases and reproductive disorders in sows).
The research was conducted in closed-loop farms with
20–120 adult sows in each basic herd. Ten farms were
tested. The required sample size was computed in
WinEpiscope 2.0 (EPIDECON), assuming an expected
prevalence of 30% and a confidence level of 95%.
Conjunctival swabs from both eyes and a swab from
the vaginal vestibule were collected from each sow. The
specimens were stabilized by using the PAXgene Tissue

Stabilizer (Qiagen, Poland) and stored at −80°C. Reference
strains of positive DNA for other chlamydial organisms
were as follows: C. suis VR-1474 (ATCC, USA), Chlamydia
trachomatis and Chlamydophila abortus (NRVI,
Puławy, Poland), Chlamydophila felis strain 905 (Merial,
France), and Chlamydophila psittaci (field isolate obtained
from birds, shared by Dr. T. Piasecki, Wroclaw University
of Environmental and Life Sciences, Poland). Mycoplasma
spp. ATCC 2391 (LGC Standards, Poland) and S. epidermidis
ATCC 35984 (PAN, Wroclaw, Poland) were included
as controls.
DNA was extracted and purified with a GeneJET Viral
DNA and RNA Purification Kit, according to the manufacturer’s
manual (Thermo Scientific, Lithuania). All
DNA samples were tested by using the qPCR procedure
described by Everett et al. [15] and sequencing the obtained
products.

Designof the assay

Primers and probe were designed by using the chlamydial
sequences available in GenBank and were evaluated
with Primer3 [17]. Table 1 shows the list of sequences of
the 23S rRNA gene and the genome sequences from
GenBank used in the development of the primers and
probes. Sequences were aligned and analysed using
MEGA6 software [18]. Figure 1 shows the sequence recognized
by the C. suis-specific LNA probe and the homologous
sequences from the closely related C.
trachomatis and Cp. abortus genomes.
Products obtained with real-time PCR were sequenced
(Genomed, Poland) and identified using BLAST (blast.
ncbi.nlm.nih.gov). Oligonucleotides were synthesized by
Sigma-Aldrich. Primer and probe sequences used for
verification of the diagnostic method are provided in
Table 2.
To validate each new set of primers, a classic PCR was
performed, followed by qPCR with SYBR Green. Next,
the qPCR was tested with the designed LNA probe. The
primer sets proposed in this study were specific for the
23S rRNA gene. Each sample was tested in triplicate.
Serial 10-fold dilutions were performed on the C. suispositive
sample to assess the test sensitivity. The spectrophotometrically
determined mean DNA concentration of
the reference strain was 6 ng/μl.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการเก็บตัวอย่างการศึกษานี้รวม 86 ฟิลด์เก็บถาวรแยกของ C. suisปี 2011-2013 ซึ่งได้มาจากทางคลินิกสุขภาพสัตว์และสุกรที่ มีคลินิกโรค (เช่นกรณีโรคตาแดงและโรคสืบพันธุ์ใน sows)การวิจัยได้ดำเนินการในฟาร์มปิดด้วยsows ผู้ใหญ่ 20-120 ในฝูงแต่ละพื้นฐาน มี 10 ฟาร์มทดสอบ ขนาดตัวอย่างต้องถูกคำนวณในWinEpiscope 2.0 (EPIDECON), โดยที่คาดว่าส่วน 30% และระดับความเชื่อมั่น 95%Swabs conjunctival จากตาและกวาดจากvestibule ช่องคลอดถูกเก็บรวบรวมจากเสาแต่ละไว้เป็นตัวอย่างได้เสถียร โดยใช้เนื้อเยื่อ PAXgeneโคลง (Qiagen โปแลนด์) และถูกเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส อ้างอิงสายพันธุ์ของดีเอ็นเอบวกสำหรับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ chlamydialมีดังนี้: C. suis VR-1474 (ATCC สหรัฐอเมริกา) Chlamydiatrachomatis และ abortus Chlamydophila (NRVIPuławy โปแลนด์), 905 (Merial สายพันธุ์สกุลแมว Chlamydophilaฝรั่งเศส), และ psittaci Chlamydophila (ฟิลด์แยกได้จากนก ร่วม โดยดร.ต. Piasecki มหาวิทยาลัยอว์ของสิ่งแวดล้อม และ วิทยาศาสตร์สุขภาพ โปแลนด์) Mycoplasmaโอ ATCC 2391 (มาตรฐาน LGC โปแลนด์) และ S. epidermidisATCC 35984 (PAN อว์ โปแลนด์) ถูกรวมเป็นการควบคุมสกัดดีเอ็นเอ และบริสุทธิ์ที่ มี GeneJET Viralดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอฟอกชุด ตามของผู้ผลิตด้วยตนเอง (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ลิทัวเนีย) ทั้งหมดทดสอบตัวอย่างดีเอ็นเอโดยวิธี qPCRอธิบายโดยเอเอส al. [15] และลำดับเบสที่ได้รับผลิตภัณฑ์Designof การทดสอบไพรเมอร์และโพรบถูกออกแบบ โดยใช้การ chlamydialลำดับใน GenBank และถูกประเมินกับ Primer3 [17] ตารางที่ 1 แสดงรายการลำดับของ23S rRNA ยีนและลำดับกลุ่มจากใช้ในการพัฒนาของไพรเมอร์ที่ GenBank และคลิปปากตะเข้ มีจัดลำดับ และ analysed ใช้ซอฟต์แวร์ MEGA6 [18] รูปที่ 1 แสดงลำดับการรับรู้โดยโพรบ LNA เฉพาะ C. suis ที่ homologousลำดับจากซีที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดtrachomatis และ Cp. abortus genomesมีการเรียงลำดับผลิตภัณฑ์ที่ได้รับกับ PCR แบบเรียลไทม์(Genomed โปแลนด์) และใช้ระเบิด (ระเบิดncbi.nlm.nih.gov) . Oligonucleotides ถูกสังเคราะห์โดยซิกมา-Aldrich ลำดับรองพื้นและโพรบใช้สำหรับตรวจสอบวิธีการวินิจฉัยที่มีอยู่ในตารางที่ 2การตรวจสอบแต่ละชุดใหม่ของไพรเมอร์ PCR คลาสสิกถูกดำเนินการ ตาม qPCR กับ SYBR Green ถัดไปqPCR การถูกทดสอบกับโพรบ LNA ออก ที่ชุดรองพื้นที่นำเสนอในการศึกษานี้ได้เฉพาะสำหรับการ23S rRNA ยีน แต่ละอย่างได้รับการทดสอบใน triplicateDilutions 10-fold ประจำดำเนินบน suispositive cตัวอย่างการประเมินความไวของการทดสอบ Spectrophotometricallyกำหนดหมายถึงดีเอ็นเอเข้มข้นสายพันธุ์อ้างอิง 6 ng μl ได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการเก็บตัวอย่างการศึกษาด้านจดหมายเหตุจำนวน 86 . ซุย
จากปี 2011 – 2013 ซึ่งได้มาจากคลินิกสุขภาพสัตว์และสุกร
ที่มีความผิดปกติทางคลินิก ( เช่น
ตาแดงกรณีและการสืบพันธุ์ผิดปกติในแม่สุกร ) .
วิจัยในฟาร์มปิดด้วย
20 – 120 ผู้ใหญ่หว่านพื้นฐานในแต่ละฝูง 10 ฟาร์ม
ทดสอบต้องคำนวณขนาดตัวอย่างใน
winepiscope 2.0 ( epidecon ) สมมติว่าคาดว่า
ความชุกของ 30% และระดับความเชื่อมั่น 95 %
การจากตาทั้งสองข้าง และ swabs ผ้า จาก
ด้นโยนีถูกเก็บจากแต่ละหว่าน
ตัวอย่างมีเสถียรภาพโดยการใช้ paxgene เนื้อเยื่อ

โคลง ( QIAGEN , โปแลนด์ ) เก็บที่อุณหภูมิ 80 องศา บริษัท เวสเทิร์น อ้างอิง
DNA บวกอื่น ๆเลียนแบบสิ่งมีชีวิต
ดังนี้ C ซุย vr-1474 ( ATCC , USA ) , Chlamydia trachomatis และแคลมิโดฟิลา บอตัส ( nrvi

PU , ł ออย โปแลนด์ ) , แคลมิโดฟิลาเฟลิส 905 ( สายพันธุ์ต่างๆ
, ฝรั่งเศส ) , และแคลมิโดฟิลา psittaci ( สาขาแยก )
จากนกร่วมกัน โดย ดร. ต. Piasecki มหาวิทยาลัยบาย
, วิทยาศาสตร์ , สิ่งแวดล้อมและชีวิตของโปแลนด์ ) Mycoplasma
spp .โดย 2391 ( lgc มาตรฐาน , โปแลนด์ ) และ S .
) อาหาร 35984 ( แพน โรคลอว์ , โปแลนด์ ) รวมเป็นการควบคุม
.
ดีเอ็นเอบริสุทธิ์กับ genejet DNA และ RNA ไวรัส
ชุดบำบัดน้ำเสีย ตามคู่มือของผู้ผลิต ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์
, ลิทัวเนีย ) ตัวอย่างดีเอ็นเอทั้งหมด
ทดสอบโดยใช้กระบวนการ qpcr
อธิบายโดย Everett et al . [ 15 ] และได้

สินค้าของออกแบบไพรเมอร์ (

และ probe ที่ออกแบบโดยการเลียนแบบ
ลำดับมีอยู่ในขนาดและประเมิน
กับ primer3 [ 17 ] ตารางที่ 1 แสดงรายการลำดับของยีนและ 23s rRNA

ขนาดจีโนมลำดับจากที่ใช้ในการพัฒนาไพรเมอร์และ
เครื่องมือตรวจสอบ ลำดับ ชิด และวิเคราะห์โดยใช้
mega6 ซอฟต์แวร์ [ 18 ] รูปที่ 1 แสดงลำดับการยอมรับ
โดย C . ซุยเฉพาะ LNA สอบสวนและเปรียบเทียบลำดับจากที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด

C . trachomatis และซีพี บอตัสจีโนม .
ผลิตภัณฑ์ได้รับด้วย PCR แบบเรียลไทม์เป็นลำดับ
( genomed , โปแลนด์ ) และระบุการใช้ระเบิด ( ระเบิด
ncbi . nlm . NIH . gov ) โอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์โดย
ซิกม่า อัลดริช ไพรเมอร์และตรวจสอบลำดับใช้
ตรวจสอบวิธีวินิจฉัยไว้
ตารางที่ 2 .
เพื่อตรวจสอบแต่ละชุดใหม่ของไพรเมอร์ , PCR คลาสสิกคือ
ดำเนินการตาม qpcr กับ SYBR กรีน ต่อไป
qpcr ถูกทดสอบกับสารละลายที่ออกแบบด้วย
primer ชุดเสนอในการวิจัยที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ
23s rRNA ยีน แต่ละตัวอย่างถูกทดสอบทั้งสามใบ
อนุกรม 10 วิธีการพับจำนวนตัวอย่าง suispositive
C เพื่อประเมินการทดสอบความไวการกำหนดหมายถึงความเข้มข้นของดีเอ็นเอนี้

อ้างอิงเมื่อย 6 ng / μ L