Materials and methodsCell cultureAl

Materials and methods
Cell culture
All cell culture media and reagents were obtained from Invitrogen (Burlington, ON). 293 (Graham et al., 1977), 293N3S (Graham, 1987) and A549 (American Type Culture Collection) cells were grown in monolayer in minimum essential medium (MEM) supplemented with 2 mM Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and 10% foetal bovine serum (FBS). MN1 cells (Salazar-Grueso et al., 1991) were maintained in Dulbecco׳s modified Eagle׳s medium (DMEM, Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS, 2 mM l-Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and were a kind gift of Dr. Jocelyn Cote (University of Ottawa). C2C12 cells (Blau et al., 1985) were grown in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM l-glutamine, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and confluent plates were switched to medium supplemented with 2% horse serum to induce differentiation. C2C12 cells were allowed to differentiate for 4 days before infection.

Generation and propagation of viruses
All of the viruses used in this study are deleted of the Ad5 early region 1 (E1) and E3 regions, and were generated and propagated using standard techniques (Ross and Parks, 2009). A plasmid containing an Ad5 genome encoding a modified fibre protein with the Ad9 shaft and Ad5 knob was obtained from Drs. Dmitry Shayakhmetov and Andre Lieber (University of Washington) (Shayakhmetov and Lieber, 2000). The modified fibre gene was subcloned into an E1/E3-deleted Ad genomic plasmid, pRP2014 (Christou and Parks, 2011 and Poulin et al., 2010), and a cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter-lacZ expression cassette (pCA38, (Addison et al., 1997)) was introduced to replace the E1-deletion, using RecA-mediated recombination (Chartier et al., 1996), as detailed previously (Willemsen, 2009), and designated Ad5SlacZ. To introduce the poly-lysine motif into the H–I loop of the knob domain of the short fibre, a BglII/PstI fragment containing part of the knob domain was first subcloned into pSP72 (Promega). This plasmid was PCR amplified with the synthetic oligonucleotides 5′ ata gcc ggc aaa aag aaa aag aaa aag aaa gga gca cca agt gca tac tct atg tca ttt tca tg 3′ and 5′ taa gcc ggc agt tgt gtc tcc tgt ttc ctg tgt acc g 3′, which prime in opposite directions around the plasmid, creating a linear molecule with compatible NgoMIV ends. Recircularization of the plasmid creates a molecule encoding a short fibre knob domain that has been changed from amino acids GDTT-PSAY to GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY. The modified fibre protein was recombined into pRP2014 to replace the native Ad5 fibre, and the CMV-lacZ expression cassette added to replace the E1-deletion, and designated Ad5SpKlacZ. Recombination of pCA38 and pRP2014 generated the control virus Ad5LlacZ. Particle counts were used to determine the titre of the vector; an aliquot of virus was diluted in assay buffer (1 mM EDTA, 0.1 SDS), heated for 20 min at 65 °C, and the absorbance determined as 1 A260=1.1×1012 particles.

Immunoblot analysis
To examine the level of incorporation of the modified fibre proteins, we assayed dilutions of the virus stock for hexon (loading control) and fibre signal by immunoblot. Viruses were diluted to 109 viral particles in a total of 10 μl of PBS, and combined with equal volume of 2× SDS/PAGE protein loading buffer (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 0.01% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol). Samples were boiled for 5 min, and separated by electrophoresis on a 12% SDS–polyacrylamide gel. The separated proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P, Millipore) and the membrane was probed with an antibody raised against all Ad capsid proteins (ab6982, 1/10,000; Abcam) or fibre (MS-1027-P0, 1/1000, NeoMarkers). Binding of the primary antibody was detected using a goat or mouse anti-rabbit secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (BioRad) and visualised by chemiluminescence reaction (Thermo Scientific ECL western blotting substrate) and autoradiography.

Infection assays in vitro
Triplicate 35 mm dishes of A549, MN1, or undifferentiated or differentiated C2C12 were seeded at a density of 0.3×106 cells per dish. The next day cells were infected at an multiplicity of infection (MOI) of 10 with Ad5LlacZ, Ad5SlacZ or Ad5SpKlacZ (or mock infected), except for one series of C2C12 cells, which was switched to differentiation medium (DMEM+2%HS), and infected after 4 days of differentiation. Crude protein extracts were prepared from the infected cells 24 h later by lysing the cells with 175 μl of Lysis Solution (Applied Biosystems). The samples were centrifuged at 9400g for 2 min at room temperature (RT) and the supernatant collected and stored at −80 °C. The samples were thawed and assayed for β-galactosidase (β-gal) activity using a commercial chemiluminescence assay (Galacto-star, Applied Biosystems) and a 20/20n luminometer (Turner BioSystems).

In vivo injections and tissue harvest
All animal experiments were approved by and performed according to the guidelines set by the Animal Research Ethics Board at the University of Ottawa (Ottawa, ON, Canada). Six to eight week-old C57Bl/6J mice (Charles River) were injected intravenously (IV) through the tail vein or intraperitoneally (IP) with 100 μl virus or PBS, or anaesthetised with halothane, and injected with virus or PBS in a volume of 25–30 μl in both the right and left tibialis anterior (TA) muscles. Three viral concentrations were used: 5×1011 VP/kg (low), 1×1012 VP/kg (middle) and 5×1012 VP/kg (high). One, two or three days later (as indicated in the specific experiment described below), the mice were euthanized with 100 μl euthanyl (CDMV Inc., Quebec City, QC). For determining the level of β-gal activity, liver and TA muscles from treated animals were removed and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C until processed as described below. For immunohistochemistry, TA muscles and the spinal cord were removed and immediately incubated in 2% paraformaldehyde (PFA) for 1 h, washed 3 times with PBS, and then incubated in 30% sucrose in PBS for 24–72 h. Tissues were equilibrated in 50:50 30% sucrose/OCT (Tissue-Tek 4583, VWR) for 1–2 h on a rocking platform. Samples were embedded in the same 50:50 mixture by flash freezing in liquid nitrogen and stored at −80 °C until sectioning. The tissues were sectioned using a cryostat in transverse or longitudinal 12 µm sections, mounted on a glass slide, and stored at −20 °C.

β-galactosidase staining
Tissue sections were hydrated in PBS for 1–2 min then fully submerged in X-gal stain (5 mM K4Fe(CN)6, 5 mM K3Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, 1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside in PBS) for 24 h at 37 °C. Slides were washed in PBS for 1 min and covered with a glass cover slip in a 1:1 mixture of PBS and 30% glycerol. Quantification of the stained areas was performed using Image J (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA). A colour intensity threshold was applied to determine the area of the muscle section showing X-gal staining, which is reported as the percentage of the total cross-sectional area of the muscle.

To examine the efficiency of retrograde transport to motor neurons after TA injection, mice were injected with 5×1012 VP/kg of Ad5LlacZ, Ad5SlacZ and Ad5SpKlacZ in a solution containing 16 mg/ml Texas Red-conjugated 3000 MW Dextran. The Texas-Red-conjugated Dextran is taken up by the motor neuron termini, and undergoes retrograde transport to mark the motor neuron cell body (Nance and Burns, 1990). Spinal cords were removed 48 h post-injection. Tissues were fixed as described above and longitudinal sections were collected until Texas Red stained-motor neurons were detected by immunofluorescence. The next sequential section was then stained for β-gal activity and viewed using a Leica M80 microscope.

Chemiluminescent β-galactosidase assay
The liver samples were processed as previously described (Parks et al., 1999). Briefly, the entire liver was homogenised in 1 ml of PBS using a Power Gen 125 (Fisher Scientific) at a speed of 5.5 for approximately 10 s. The samples were sonicated twice for 15 s on ice, with a 10 s rest period in between. Samples were centrifuged at 375g for 5 min and the supernatant removed to a fresh tube. TA muscles where pulverised using a liquid nitrogen chilled-mortar and pestle. The ground muscle was transferred to a microfuge tube, and solubilized in 400 μl RIPA buffer (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% glycerol, 1% NP40, and protease inhibitors). Both liver and TA muscle samples were heated in a 55 °C water bath for 15 min (to inactivate endogenous β-gal activity), followed by a final centrifugation at 16000g for 10 min. The supernatants were collected and assayed for β-gal activity using a commercial kit (Galacto-star, Applied Biosystems) and a 20/20n luminometer (Turner BioSystems). Data was normalised to the amount of protein in each sample, as determined by Bradford assay (BioRad).

Statistical analysis
SigmaStat 2.0 was used to determine statistical significance. All error bars represent standard deviation and the p-Value was set to 0.05.

Acknowledgments
We thank Kathy Poulin, Melissa Geoffroy, Kalisa Campbell, Natacha Provost, Kristin Willemsen and Benoit Goulet for technical assistance. We thank Dr. Justin Boyer and Chantal Mazerolle for advice on mouse surgery. Research in the Parks laboratory is supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP102554, MOP136898), the Canadian Foundation for Innovation (29974), and the National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (238824-2012). E.R.M. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Ontario Provincial Government and a scholarship from the CIHR. R.K. is a recipient of a University Health Research Chair from the University of Ot

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์สื่อวัฒนธรรมเซลล์และ reagents ทั้งหมดได้รับมาจาก Invitrogen (เบอร์ลิงตัน ON) 293 (เกรแฮม et al., 1977), 293N3S (แกรแฮม 1987) และเซลล์ (อเมริกันวัฒนธรรมคอลเลกชันชนิด) ถูกปลูก monolayer ในกลางจำเป็นต่ำสุด (MEM) เสริม ด้วย 2 มม. Glutamax, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยาเพนนิซิลลิน และ 10% foetal วัวซีรั่ม (FBS) A549 เซลล์ MN1 (Salazar Grueso et al., 1991) ถูกจัดเก็บอยู่ใน Dulbecco׳s ปรับเปลี่ยนสื่อ Eagle׳s (DMEM ซิก Aldrich) เสริม ด้วย 10% FBS, l-Glutamax มม. 2, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยา เพนนิซิลลิน และของขวัญประเภทของดร. Jocelyn โกตดิ (มหาวิทยาลัยออตตาวา) C2C12 เซลล์ (Blau และ al., 1985) ได้เติบโตขึ้นใน DMEM เสริม ด้วย 10% FBS, 2 มม. l glutamine, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยา เพนนิซิลลิน และแผ่น confluent ถูกสลับไปยังสื่อเสริม ด้วยเซรั่มม้า 2% เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่าง เซลล์ C2C12 ได้รับอนุญาตให้แยกความแตกต่างสำหรับ 4 วันก่อนที่จะติดเชื้อการสร้างและการแพร่กระจายของไวรัสไวรัสที่ใช้ในการศึกษานี้ทั้งหมดจะถูกลบ Ad5 ก่อนภาค 1 (E1) และ E3 ภูมิภาค และสร้างขึ้น และเผยแพร่การใช้เทคนิคมาตรฐาน (รอสส์และสวนสาธารณะ 2009) Plasmid ที่ประกอบด้วยจีโนม Ad5 เข้ารหัสโปรตีนเส้นใยปรับเปลี่ยนเพลา Ad9 และกิ๊ป Ad5 ได้รับจากดร.ดิ Shayakhmetov และ Andre Lieber (มหาวิทยาลัยวอชิงตัน) (Shayakhmetov และ Lieber, 2000) ยีนไฟเบอร์แก้ไขเป็น subcloned ในการโฆษณา E1/E3-ลบ genomic plasmid, pRP2014 (Christou และสวน สาธารณะ 2011 และ Poulin et al., 2010), และ cytomegalovirus ทันทีก่อนเพิ่มโปรโมเตอร์-lacZ นิพจน์อับ (pCA38 (แอดดิสันและ al., 1997)) ถูกนำมาใช้แทนการ E1-ลบ ใช้ RecA mediated recombination (Chartier et al., 1996), รายละเอียดก่อนหน้านี้ (Willemsen, 2009), และกำหนด Ad5SlacZ แนะนำแปลนไลซีนโพลีเป็น H – ฉันวนโดเมนกิ๊ปของเส้นใยสั้น ส่วน BglII/PstI ประกอบด้วยส่วนของโดเมนกิ๊ปที่แรก subcloned เป็น pSP72 (Promega) Plasmid นี้ถูกขยาย ด้วยการสังเคราะห์ oligonucleotides 5′ ata gcc ggc aaa เอเอจีเอเอเอเอเอจีเอเอเอเอเอจี aaa gga gca cca agt PCR gca มาตรวัด tct atg tca ที tca tg 3′ และ 5′ แหลมยายณี gcc ggc agt tgt gtc tcc tgt ทีทีซีจำกัด ctg tgt บัญชี g 3′ ซึ่งเฉพาะในทิศทางตรงกันข้ามสถาน plasmid สร้างโมเลกุลเชิงเส้นสิ้นสุด NgoMIV เข้ากัน Recircularization ของ plasmid สร้างโมเลกุลเข้าโดเมนกิ๊ปเส้นใยสั้นที่ได้เปลี่ยนจากกรดอะมิโน GDTT-PSAY GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY โปรตีนเส้นใยที่ถูกปรับเปลี่ยนถูก recombined เป็น pRP2014 แทนใย Ad5 ดั้งเดิม และเทปนิพจน์ CMV lacZ เพิ่มเข้าไปแทนการลบ E1 และกำหนด Ad5SpKlacZ Recombination ของ pCA38 และ pRP2014 สร้างไวรัสควบคุม Ad5LlacZ ใช้กำหนด titre ของเวกเตอร์ จำนวนอนุภาค ส่วนลงตัวที่ไวรัสถูกผสมในบัฟเฟอร์การทดสอบ (1 mM EDTA, 0.1 SDS), อุ่นสำหรับ 20 นาทีที่ 65 ° C และ absorbance ที่กำหนด 1 A260 = 1.1 × 1012 อนุภาควิเคราะห์ Immunoblotตรวจสอบระดับของการประสานของโปรตีนเส้นใยปรับเปลี่ยน เรา assayed dilutions หุ้นไวรัส hexon (โหลดควบคุม) และสัญญาณไฟเบอร์ โดย immunoblot ไวรัสถูกผสมกับอนุภาคไวรัส 109 ในทั้งหมด 10 μl ของ PBS และรวมกับระดับเสียงเท่ากับ 2 × SDS/หน้า โปรตีนโหลดบัฟเฟอร์ (62.5 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 6.8 กลีเซอร 25%, 2% SDS, 0.01% bromophenol บลู 5% β-mercaptoethanol) ตัวอย่างมีต้มสำหรับ 5 นาที และคั่น ด้วย electrophoresis ใน 12% SDS – polyacrylamide เจ โปรตีนที่แยกได้โอนย้ายไปที่เยื่อหุ้ม difluoride polyvinylidene (Immobilon P มาก) และเมมเบรนจะถูกพิสูจน์ ด้วยแอนติบอดีที่ขึ้นกับโปรตีน capsid โฆษณาทั้งหมด (ab6982, 1/10000 Abcam) หรือเส้นใย (MS-1027-P0, 1/1000, NeoMarkers) ผูกของแอนติบอดีหลักพบใช้แพะ หรือเมาส์กระต่ายป้องกันรองแอนติบอดีกลวงเพื่อ horseradish peroxidase (BioRad) และ visualised โดย autoradiography chemiluminescence ปฏิกิริยา (เทอร์โม ECL วิทยาศาสตร์ตะวันตก blotting วิธีพื้นผิว)การเพาะเลี้ยงเชื้อ assaysจาน 35 มม. triplicate A549, MN1 หรือ undifferentiated หรือสังเกต C2C12 ถูก seeded ที่ความหนาแน่นของ 0.3 × 106 เซลล์ต่อจาน เซลล์วันถัดไปติดเชื้อที่มีมากมายหลายหลากของเชื้อ (อย) 10 กับ Ad5LlacZ, Ad5SlacZ หรือ Ad5SpKlacZ (หรือจำลองสินค้ารวมติด), ยกเว้นเซลล์ C2C12 หนึ่งชุดซึ่งสร้างความแตกต่างปานกลางสลับ (DMEM + 2% HS), และการติดเชื้อหลังจาก 4 วันของการสร้างความแตกต่าง สารสกัดจากโปรตีนหยาบถูกเตรียมจากเซลล์ติดเชื้อ 24 h ในภายหลัง โดย lysing เซลล์กับ 175 μl Lysis โซลูชัน (Biosystems ใช้) ตัวอย่างถูก centrifuged ที่ 9400g 2 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) และ supernatant รวบรวม และจัดเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส ตัวอย่างถูก thawed และ assayed สำหรับกิจกรรมβ-galactosidase (β-gal) ใช้ทดสอบ chemiluminescence พาณิชย์ (ดาว Galacto, Biosystems ใช้) และ luminometer 20/20n (Turner BioSystems)ฉีดในสัตว์ทดลองและการเก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อสัตว์ทดลองทั้งหมดได้อนุมัติ และดำเนินการตามแนวทางที่กำหนด โดยคณะกรรมการจริยธรรมวิจัยสัตว์ที่ของที่นี่ (ออตตาวา ON แคนาดา) หกถึงแปดสัปดาห์เก่า C57Bl/6J หนู (แม่น้ำชาร์ลส์) ถูกฉีด intravenously (IV) ผ่านหลอดเลือดดำหาง หรือ intraperitoneally (IP) ด้วย μl ไวรัสหรือ PBS, 100 หรือ anaesthetised กับ halothane และฉีดไวรัสหรือ PBS ปริมาณของ μl 25 – 30 ในทั้งด้านขวา และซ้ายแอนทีเรียร์ (TA) กล้ามเนื้อ tibialis ใช้ความเข้มข้นไวรัส 3: 5 × 1011 VP/kg (ต่ำ), 1 × 1012 VP/kg (กลาง) และ 5 × 1012 VP/kg (สูง) หนึ่ง สอง หรือสามวันภายหลัง (ตามระบุในทดลองเฉพาะที่อธิบายไว้ด้านล่าง), เมาส์มี euthanized กับ euthanyl μl 100 (CDMV Inc. ควิเบก QC) ในการกำหนดระดับของกิจกรรมβ gal ตับและกล้ามเนื้อตาจากสัตว์บำบัดถูกเอาออกทันทีแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกว่าจะดำเนินการตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง Immunohistochemistry กล้ามเนื้อตาและสันหลังถูกเอาออก และ incubated ทันทีใน 2% paraformaldehyde (รับ) สำหรับ 1 h ล้าง 3 ครั้ง ด้วย PBS แล้ว incubated ใน 30% ซูโครสใน PBS สำหรับเนื้อเยื่อ h. 24-72 ถูก equilibrated ในคนละครึ่ง 30% ซูโครส/OCT (เนื้อเยื่อ-Tek 4583, VWR) สำหรับ 1-2 h บนแพลตฟอร์มโยก ตัวอย่างถูกฝังอยู่ในส่วนผสมคนละครึ่งเดียว โดยแฟลชแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 ° C จน sectioning เนื้อเยื่อถูกจัดแบ่งเป็นส่วน ๆ ใช้ cryostat ยัง transverse หรือระยะยาว 12 µm ส่วน ติดบนสไลด์แก้ว และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียสΒ-galactosidase ย้อมสีส่วนเนื้อเยื่อถูก hydrated ใน PBS สำหรับ 1-2 นาที แล้วแช่เต็มในคราบสาว X (5 มม. K4Fe (CN) 6, 5 มม. K3Fe (CN) 6, 2 มม. MgCl2, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside ใน PBS 1 mg/ml) ใน 24 ชมที่ 37 องศาเซลเซียส ภาพนิ่งถูกล้างใน PBS ใน 1 นาที และปกคลุม ด้วยใบฝาครอบแก้ว 1:1 ส่วนผสมของกลีเซอร PBS และ 30% นับพื้นที่ทิ้งคราบที่ดำเนินการโดยใช้รูป J (Wayne Rasband บริการสาขา แห่งชาติ สถาบันวิจัยสุขภาพจิต เบเทสดา แมริแลนด์ สหรัฐอเมริกา) ขีดจำกัดความเข้มสีถูกใช้เพื่อกำหนดพื้นที่ของกล้ามเนื้อส่วนแสดงย้อมสี กัล X ซึ่งจะรายงานเป็นจำนวนเปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ทั้งกล้ามเนื้อเหลวหมดเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของมอเตอร์ neurons retrograde มาก ๆ หลังจากฉีดยา TA หนูถูกฉีด ด้วย 5 × VP 1012/กก. ของ Ad5LlacZ, Ad5SlacZ และ Ad5SpKlacZ ในโซลูชันที่ประกอบด้วยเท็กซัสแดงกลวง 3000 MW เดกซ์แทรน 16 mg/ml เดกซ์แทรนเท็กซัสสีแดงกลวงถูกใช้ไป โดยเทอร์มินิประสาท และผ่านขนส่ง retrograde จะทำเครื่องหมายตัวเซลล์ประสาท (Nance และไหม้ 1990) สไปนัลสาย h เอา 48 หลังฉีดได้ เนื้อเยื่อได้คงที่ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และส่วนระยะยาวถูกรวบรวมจนกว่าจะตรวจพบ โดย immunofluorescence neurons มอเตอร์สีแดงเท็กซัส ส่วนลำดับถัดไปที่สีแล้วสำหรับกิจกรรมβ gal และดูโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ไล M80Chemiluminescent β-galactosidase วิเคราะห์ตัวอย่างตับถูกประมวลผลเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (สวนร้อยเอ็ด al., 1999) สั้น ๆ ถูก homogenised ใน 1 ml ของ PBS ที่ใช้ 125 Gen พลังงานมี (Fisher วิทยาศาสตร์) ตับทั้งหมดที่ความเร็ว 5.5 ประมาณ 10 s ตัวอย่างที่ sonicated สองครั้งสำหรับ 15 s บนน้ำแข็ง กับ 10 s เหลือระยะเวลาในระหว่างการ ตัวอย่างที่ centrifuged ที่ 375g 5 นาทีและ supernatant ออกไปท่อสด ตากล้ามเนื้อใช้กับไนโตรเจนเหลวแช่- โกร่ง pulverised กล้ามเนื้อดินถูกโอนย้ายไปหลอด microfuge และ solubilized ในบัฟเฟอร์ 400 μl ริป้าราคา (50 มม.ตรีค่า pH 8.0, 100 มม. NaCl, 1 mM EDTA กลีเซอร 1%, 1% NP40 และรติเอส inhibitors) ตับและตัวอย่างกล้ามเนื้อตาได้ประกอบในน้ำน้ำ 55 ° C สำหรับ 15 นาที (เพื่อยกกิจกรรม endogenous β gal), ตาม ด้วย centrifugation ขั้นสุดท้ายที่ 16000g สำหรับ 10 นาที Supernatants ถูกรวบรวม และ assayed สำหรับβ gal กิจกรรมโดยใช้ชุดพาณิชย์ (ดาว Galacto, Biosystems ใช้) และ luminometer 20/20n (Turner BioSystems) ข้อมูลถูก normalised โปรตีนในแต่ละอย่าง จำนวนที่ทดสอบแบรดฟอร์ด (BioRad)วิเคราะห์ทางสถิติSigmaStat 2.0 ถูกใช้เพื่อกำหนดนัยสำคัญทางสถิติ แถบข้อผิดพลาดทั้งหมดแทนส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และค่า p ถูกตั้งค่าเป็น 0.05ตอบเราขอขอบคุณเคธี Poulin เมลิสซา Geoffroy, Kalisa Campbell, Natacha Provost, Kristin Willemsen และ Goulet เบนวาขอความช่วยเหลือทางเทคนิค เราขอบคุณดร. Justin Boyer และ Mazerolle ชั่นสำหรับคำแนะนำการผ่าตัดของเมาส์ วิจัยสวนห้องปฏิบัติสนับสนุนทุนจากแคนาดาสถาบันของสุขภาพวิจัย (CIHR) (MOP102554, MOP136898), มูลนิธิแคนาดานวัตกรรม (29974), ศาสตร์แห่งชาติ และวิศวกรรมวิจัยสภา (NSERC) (238824-2012) E.R.M. ได้รับการสนับสนุน โดยที่ออนตาริโอบัณฑิตทุนการศึกษาจากรัฐบาลจังหวัดออนตาริโอและเป็นทุนการศึกษาจาก CIHR อาร์เคจะได้รับเก้าอี้วิจัยสุขภาพมหาวิทยาลัยจากมหาวิทยาลัย Ot

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เพาะเลี้ยงเซลล์
ทุกเซลล์เพาะเลี้ยงและสารเคมีที่ได้รับจาก Invitrogen (เบอร์ลิงตัน, ON) 293 (เกรแฮม et al., 1977) 293N3S (เกรแฮม, 1987) และ A549 (American ประเภทวัฒนธรรมเก็บ) เซลล์ที่ถูกปลูกใน monolayer ในสื่อสิ่งจำเป็นขั้นต่ำ (MEM) เสริมด้วย 2 มิลลิ Glutamax 0.1 มก. / มล streptomycin และ 100 U / ml penicillin, และ 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) เซลล์ MN1 (ซัลลาซาร์-Grueso et al., 1991) ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน Dulbecco ของการปรับเปลี่ยน Eagle ของกลาง (DMEM, Sigma-Aldrich) เสริมด้วย FBS 10%, 2 มิลลิ L-Glutamax 0.1 มก. / มล streptomycin และ 100 U / ml penicillin และเป็นของที่ระลึกชนิดของดร. โจเซลีนโก (มหาวิทยาลัยออตตาวา) เซลล์ C2C12 (Blau et al., 1985) ได้รับการปลูกใน DMEM เสริมด้วย FBS 10%, 2 มิลลิ L-glutamine, 0.1 มก. / มล streptomycin และ 100 U / penicillin มิลลิลิตรและแผ่นไหลมารวมกันถูกเปลี่ยนไปขนาดกลางเสริมด้วยม้า 2% ซีรั่มที่จะทำให้เกิดความแตกต่าง เซลล์ C2C12 ได้รับอนุญาตให้แยกความแตกต่างเป็นเวลา 4 วันก่อนที่จะติดเชื้อ. ผลิตและการขยายพันธุ์ของไวรัสทั้งหมดของไวรัสที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้จะถูกลบออกของภูมิภาคในช่วงต้น Ad5 1 (E1) และภูมิภาค E3 และถูกสร้างขึ้นและการขยายพันธุ์โดยใช้เทคนิคมาตรฐาน (รอสส์ และสวนสาธารณะ, 2009) พลาสมิดที่มีจีโนมการเข้ารหัส Ad5 เส้นใยโปรตีนที่ถูกแก้ไขด้วยเพลา AD9 และลูกบิด Ad5 ที่ได้รับจาก Drs มิทรี Shayakhmetov และอังเดลีเบอร์ (มหาวิทยาลัยวอชิงตัน) (Shayakhmetov และลีเบอร์, 2000) ยีนเส้นใยแก้ไขถูก subcloned เป็น E1 / E3 ลบโฆษณาพลาสมิดจีโนม pRP2014 (Christou และสวนสาธารณะ, ปี 2011 และ Poulin et al., 2010) และ cytomegalovirus เพิ่มต้นทันที / โปรโมเตอร์ lacZ เทปคาสเซ็ทการแสดงออก (pCA38 (แอดดิสัน et al., 1997)) ถูกนำไปแทนที่ E1-ลบโดยใช้การรวมตัว Reca พึ่ง (Chartier et al., 1996) โดยมีรายละเอียดก่อนหน้านี้ (Willemsen, 2009) และได้รับมอบหมาย Ad5SlacZ ที่จะแนะนำบรรทัดฐานโพลีไลซีนเป็นห่วง H-I ของโดเมนลูกบิดของเส้นใยสั้น, BglII / PstI ส่วนที่มีส่วนหนึ่งของโดเมนลูกบิดถูก subcloned ครั้งแรกใน pSP72 (Promega) พลาสมิดนี้ถูกขยายด้วยวิธี PCR oligonucleotides สังเคราะห์ 5 'ATA gcc GGC AAA AAG AAA AAG AAA AAG AAA gga GCA CCA agt GCA Tac TCT ATG TCA TTT TCA TG 3' และ 5 'ไฟ gcc GGC agt TGT GTC TCC TGT Ttc ctg TGT ตามมาตรฐาน กรัม 3 'ซึ่งที่สำคัญในทิศทางตรงข้ามรอบพลาสมิด, การสร้างโมเลกุลเชิงเส้นที่มี NgoMIV ปลายที่เข้ากันได้ Recircularization ของพลาสมิดสร้างโมเลกุลเข้ารหัสโดเมนเส้นใยสั้นลูกบิดที่ได้รับการเปลี่ยนจากกรดอะมิโน GDTT-PSAY เพื่อ GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY เส้นใยโปรตีนที่ถูกดัดแปลงเป็น recombined pRP2014 เพื่อแทนที่เส้นใย Ad5 พื้นเมืองและเทปการแสดงออก CMV-lacZ เพิ่มเพื่อแทนที่ E1-ลบและได้รับมอบหมาย Ad5SpKlacZ การรวมตัวกันของ pCA38 และ pRP2014 สร้างไวรัสควบคุม Ad5LlacZ นับอนุภาคถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบกรรมสิทธิ์ของเวกเตอร์; aliquot ของไวรัสถูกเจือจางในบัฟเฟอร์ทดสอบ (1 mM EDTA, 0.1 SDS), ความร้อนเป็นเวลา 20 นาทีที่ 65 องศาเซลเซียสและการดูดกลืนแสงที่กำหนดเป็น 1 A260 = 1.1 × 1012 อนุภาค. วิเคราะห์ Immunoblot เพื่อตรวจสอบระดับของการรวมตัวกันของ แก้ไขโปรตีนใยเรา assayed เจือจางของไวรัสหุ้นสำหรับ HEXON (การควบคุมโหลด) และสัญญาณใยแก้วนำโดย immunoblot ไวรัสถูกลดลงเหลือ 109 อนุภาคของไวรัสในทั้งหมด 10 ไมโครลิตรของพีบีเอสและรวมกับปริมาณที่เท่ากันของ 2 × SDS / หน้าโปรตีนโหลดบัฟเฟอร์ (62.5 มิลลิ Tris HCl พีเอช 6.8, กลีเซอรีน 25%, 2% SDS, 0.01% Bromophenol สีฟ้า , 5% β-mercaptoethanol) ตัวอย่างที่ถูกต้มเป็นเวลา 5 นาทีและแยกจากกันโดยกระแสไฟฟ้า 12% SDS-polyacrylamide เจล โปรตีนแยกถูกโอนไปยังเมมเบรน Polyvinylidene difluoride (Immobilon-P, ค) และเมมเบรนได้รับการตรวจสอบที่มีแอนติบอดี้ขึ้นกับทุกโปรตีน capsid โฆษณา (ab6982 1 / 10,000; Abcam) หรือเส้นใย (MS-1027-P0 1 / 1000, NeoMarkers) ผูกพันของแอนติบอดีหลักที่ตรวจพบโดยใช้แพะหรือเมาส์แอนติบอดีต่อต้านกระต่ายรองผันไป peroxidase มะรุม (BioRad) และมองเห็นจากปฏิกิริยา chemiluminescence (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ECL ตั้งต้นซับตะวันตก) และเอ๊ก. การตรวจการติดเชื้อในหลอดทดลองเพิ่มขึ้นสามเท่า 35 มมอาหารของ A549 , MN1 หรือ C2C12 ความแตกต่างหรือความแตกต่างเป็นเมล็ดที่อัตราความหนาแน่น 0.3 × 106 เซลล์ต่อจาน เซลล์ในวันถัดไปมีการติดเชื้อที่หลายหลากของการติดเชื้อ (MOI) ของ 10 กับ Ad5LlacZ, Ad5SlacZ หรือ Ad5SpKlacZ (หรือที่ติดเชื้อจำลอง) ยกเว้นสำหรับหนึ่งชุดของเซลล์ C2C12 ซึ่งถูกเปลี่ยนไปขนาดกลางความแตกต่าง (DMEM + 2% HS) และการติดเชื้อหลังจาก 4 วันของความแตกต่าง สารสกัดจากโปรตีนที่เตรียมจากเซลล์ที่ติดเชื้อ 24 ชั่วโมงต่อมาโดย lysing เซลล์ที่มี 175 ไมโครลิตรของโซลูชั่น Lysis (Applied Biosystems) ตัวอย่างที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 9400g 2 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) และใสเก็บรวบรวมและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส ตัวอย่างที่ถูกละลายและ assayed สำหรับβ-galactosidase (β-gal) กิจกรรมโดยใช้การทดสอบ chemiluminescence เชิงพาณิชย์ (Galacto ดาว Applied Biosystems) และ 20 / 20n luminometer (เทอร์เนอ BioSystems). ในการฉีดร่างกายและเก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อทั้งหมดเป็นสัตว์ทดลอง ได้รับการอนุมัติและดำเนินการโดยตามแนวทางที่กำหนดโดยคณะกรรมการสัตว์จริยธรรมการวิจัยที่มหาวิทยาลัยออตตาวา (Ottawa, ON, แคนาดา) หกถึงแปดสัปดาห์เก่า C57BL / 6J หนู (ชาร์ลส์ริเวอร์) ได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (IV) ผ่านทางหลอดเลือดดำหางหรือช่องท้อง (IP) ไวรัส 100 ไมโครลิตรหรือพีบีเอสหรือดมยาสลบด้วย halothane และฉีดด้วยไวรัสหรือพีบีเอสในปริมาณ 25-30 ไมโครลิตรทั้งซ้ายและขวา tibialis ล่วงหน้า (TA) กล้ามเนื้อ สามความเข้มข้นของเชื้อไวรัสที่ใช้: 5 × 1,011 VP / kg (ต่ำ), 1 × 1,012 VP / กก. (กลาง) และ 5 × 1,012 VP / กก. (สูง) หนึ่งสองหรือสามวันต่อมา (ตามที่ระบุไว้ในการทดสอบที่เฉพาะเจาะจงอธิบายไว้ด้านล่าง) หนูถูก euthanized 100 ไมโครลิตร euthanyl (CDMV อิงค์ควิเบก, QC) สำหรับการกำหนดระดับของกิจกรรมβ-gal ตับและกล้ามเนื้อ TA จากสัตว์ที่ได้รับการรักษาที่ถูกถอดออกและแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 ° C จนการประมวลผลตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง สำหรับ immunohistochemistry กล้ามเนื้อตาและไขสันหลังที่ถูกถอดออกและบ่มทันที 2% paraformaldehyde (PFA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงล้าง 3 ครั้งด้วยพีบีเอสแล้วนำไปบ่มใน 30% น้ำตาลซูโครสในพีบีเอสสำหรับ 24-72 ชั่วโมง เนื้อเยื่อถูก equilibrated ใน 50:50 น้ำตาลซูโครส 30% / ตุลาคม (เนื้อเยื่อ-Tek 4583, VWR) 1-2 ชั่วโมงบนแพลตฟอร์มโยก ตัวอย่างที่ถูกฝังอยู่ในส่วนผสมเดียวกัน 50:50 โดยการแช่แข็งแฟลชในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 ° C จน sectioning เนื้อเยื่อถูกแบ่งโดยใช้ Cryostat ในขวางหรือตามยาว 12 ไมครอนส่วนที่ติดตั้งอยู่บนสไลด์แก้วและเก็บไว้ที่ -20 ° C. การย้อมสีβ-galactosidase เนื้อเยื่อถูกตัดไฮเดรทในพีบีเอส 1-2 นาทีแล้วจมอยู่ใต้น้ำอย่างเต็มที่ในกระเป๋า คราบแกลลอน (5 มิลลิ K4Fe (CN) 6, 5 มิลลิ K3Fe (CN) 6, 2 มิลลิ MgCl2 1 mg / ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside ในพีบีเอส) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 ° C ภาพนิ่งถูกล้างในพีบีเอสเป็นเวลา 1 นาทีและปกคลุมด้วยใบฝาครอบกระจกใน 1: 1 ส่วนผสมของพีบีเอสและกลีเซอรีน 30% ปริมาณของพื้นที่ที่เปื้อนถูกดำเนินการโดยใช้ภาพ J (เวย์นราสแบนด์สาขาวิจัยบริการสถาบันแห่งชาติของสุขภาพจิต, Bethesda, Maryland, USA) เกณฑ์ความเข้มของสีถูกนำไปใช้ในการกำหนดพื้นที่ของส่วนกล้ามเนื้อแสดงการย้อมสี X-gal ซึ่งจะมีการรายงานเป็นเปอร์เซ็นต์ของพื้นที่หน้าตัดรวมของกล้ามเนื้อ. เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของการขนส่งที่จะถอยหลังเข้าคลองมอเตอร์เซลล์หลังฉีด TA หนูถูกฉีดด้วย 5 × 1,012 VP / กิโลกรัม Ad5LlacZ, Ad5SlacZ และ Ad5SpKlacZ ในการแก้ปัญหาที่มี 16 mg / ml เท็กซัสแดงผัน 3,000 เมกะวัตต์ Dextran เท็กซัสแดงผัน Dextran ถูกนำขึ้นมาจากปลายทางเซลล์ประสาทมอเตอร์, และผ่านการขนส่งถอยหลังเข้าคลองเพื่อเป็นเครื่องหมายของเซลล์ประสาทมอเตอร์ร่างกาย (แนนซ์และเบิร์นส์, 1990) สายกระดูกสันหลังถูกถอดออก 48 ชั่วโมงหลังการฉีด เนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและส่วนยาวถูกเก็บรวบรวมจนถึงเท็กซัสแดงเซลล์ประสาทเปื้อนมอเตอร์ถูกตรวจพบโดย immunofluorescence ส่วนลำดับต่อไปคือการย้อมสีแล้วสำหรับกิจกรรมβ-แกลลอนและดูได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Leica M80. Chemiluminescent ทดสอบβ-galactosidase ตัวอย่างตับถูกประมวลผลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (สวนสาธารณะ et al., 1999) สั้น ๆ , ตับทั้งหมดถูกปั่นใน 1 มิลลิลิตรของพีบีเอสโดยใช้พลังงาน Gen 125 (Fisher Scientific) ที่ความเร็ว 5.5 ประมาณ 10 วินาที ตัวอย่าง sonicated สองครั้งสำหรับ 15 วินาทีบนน้ำแข็งกับ 10 วินาทีที่เหลือในช่วงระหว่าง ตัวอย่างที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 375g เป็นเวลา 5 นาทีและเหนือตะกอนออกไปหลอดสด กล้ามเนื้อตาที่แหลกลาญโดยใช้ไนโตรเจนเหลวแช่เย็นปูนและสาก กล้ามเนื้อพื้นดินได้รับการถ่ายโอนไปยังหลอด microfuge และละลายใน 400 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์ RIPA (50 mM Tris พีเอช 8.0, 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1 มิลลิ EDTA, กลีเซอรีน 1%, 1% NP40 และน้ำย่อย) ทั้งตับและ TA ตัวอย่างกล้ามเนื้อถูกความร้อนใน 55 ° C อาบน้ำนาน 15 นาที (เพื่อยับยั้งกิจกรรมβ-gal ภายนอก) ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงสุดท้ายที่ 16000g เป็นเวลา 10 นาที supernatants ถูกเก็บรวบรวมและ assayed สำหรับกิจกรรมβ-แกลลอนโดยใช้ชุดการค้า (Galacto ดาว Applied Biosystems) และ 20 / 20n luminometer (เทอร์เนอ BioSystems) ข้อมูลปกติกับปริมาณของโปรตีนในแต่ละตัวอย่างตามที่กำหนดโดยการทดสอบ Bradford (BioRad). การวิเคราะห์ทางสถิติSigmaStat 2.0 ได้รับการใช้ในการกำหนดนัยสำคัญทางสถิติ บาร์ข้อผิดพลาดทั้งหมดเป็นตัวแทนของส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานและ p-value ถูกกำหนดเป็น 0.05. กิตติกรรมประกาศเราขอขอบคุณเคที Poulin เมลิสสาเจฟฟรีย์, วิถีอุทกแคมป์เบล Natacha พระครูคริสติน Willemsen และเบอนัวต์ Goulet สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิค เราขอขอบคุณดร. จัสตินบอยเยอร์และตั Mazerolle สำหรับคำแนะนำเกี่ยวกับการผ่าตัดเมาส์ การวิจัยในสวนสาธารณะห้องปฏิบัติการได้รับการสนับสนุนโดยเงินทุนจากสถาบันแคนาดาวิจัยสุขภาพ (CIHR) (MOP102554, MOP136898), มูลนิธิแคนาดาสำหรับนวัตกรรม (29974) และวิทยาศาสตร์และวิศวกรรมแห่งชาติสภาวิจัย (NSERC) (238824-2012) . ERM ได้รับการสนับสนุนโดยทุนการศึกษาจบการศึกษาจากออนตาริออนตาริรัฐบาลและทุนการศึกษาจาก CIHR RK เป็นผู้รับเก้าอี้สุขภาพการวิจัยมหาวิทยาลัยจากมหาวิทยาลัย Ot

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์ทุกเซลล์

วัฒนธรรมสื่อและสารเคมีได้จาก Invitrogen ( เบอร์ลิงตัน ) 293 ( เกรแฮม et al . , 1977 ) 293n3s ( Graham , 1987 ) และ a549 ( ประเภทคอลเลกชันเซลล์เติบโตในวัฒนธรรมอเมริกัน ) อย่างในขั้นต่ำจำเป็นขนาดกลาง ( แหม่ม ) เสริมด้วย glutamax 2 มม. , 0.1 มก. / มล. และ streptomycin 100 U / ml เพนนิซิลลิน และ 10% เซรั่มวัว foetal ( FBS )mn1 เซลล์ ( ซาลา grueso et al . , 1991 ) ถูกเก็บรักษาไว้ในดัลเบโค่׳ s แก้ไข׳ของนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ซิกม่า Aldrich , 10% ) เสริมด้วย FBS 2 มม. l-glutamax 0.1 มก. / มล. และ streptomycin 100 U / ml เพนนิซิลิน และเป็นประเภทของขวัญของดร. โจเซลิน เฟรนช์ ( มหาวิทยาลัยออตตาวา ) . c2c12 เซลล์ ( บลาว et al . , 1985 ) เติบโตในระดับ 10% FBS dmem Glutamine , 2 - 01 มก. / มล. และ streptomycin 100 U / ml เพนนิซิลลิน และแผ่นกระจู๋กระจี๋สลับกันกับอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย 2 % ม้า เซรั่มเพื่อก่อให้เกิดความแตกต่าง . c2c12 เซลล์ได้รับอนุญาตให้แยก 4 วันก่อนการติดเชื้อ

รุ่นและการขยายพันธุ์ของไวรัส
ทั้งหมดของไวรัสที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้เป็นลบของ ad5 ก่อนภาค 1 ( E1 ) และ E3 ภูมิภาคและถูกสร้างขึ้นและทำให้การใช้เทคนิคมาตรฐาน ( Ross และสวนสาธารณะ , 2009 ) เป็นสายพันธุ์ที่มี ad5 จีโนมดัดแปลงโปรตีนใยการเข้ารหัสด้วย ad9 เพลาและ ad5 ลูกบิดได้จาก Drs . Dmitry shayakhmetov กับอังเดร เลเบอร์ ( University of Washington ) ( shayakhmetov และ เลเบอร์ , 2000 ) การดัดแปลงยีนของเส้นใยเป็น E1 / E3 ลบโฆษณาพลาสิก ,prp2014 ( christou และสวนสาธารณะ , 2011 และพูแลน et al . , 2010 ) และ cytomegalovirus ทันทีก่อนการเพิ่ม / lacz การแสดงออกเทป ( pca38 ( แอดดิสัน , et al . , 1997 ) แนะนำแทนการลบ E1 โดยใช้รีก้า ( recombination ( chartier et al . , 1996 ) ( ตามรายละเอียดก่อนหน้านี้ willemsen , 2009 ) , และเขต ad5slacz .แนะนำ โพลี ซีนแม่ลายเป็น H –ฉันห่วงของลูกบิดโดเมนของเส้นใยสั้น bglii / โคลนชิ้นที่มีส่วนของลูกบิดของโดเมนเป็นครั้งแรกใน psp72 ( promega )สายพันธุ์นี้เป็นเทคนิคของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ 5 ’ ATA GCC ggc AAA AAA AAA เท่านั้นเท่านั้น AAG AAA ก๊ะ GCA CCA agt GCA TAC TCT ATG TCA TTT TCA TG 3 และ 5 นั้นได้รับการให้ GCC ggc agt TGT GTC TCC TGT ttc CTG TGT ACC G 3 ’ ซึ่งเฉพาะในทิศทางตรงกันข้ามรอบพลาสมิด , การสร้าง โมเลกุลเชิงเส้นกับเข้ากันได้ ngomiv สิ้นสุดrecircularization ของพลาสมิดที่สร้างโมเลกุลสั้นเส้นใยลูกบิดโดเมนที่ถูกเปลี่ยนจากกรดอะมิโน gdtt-psay เพื่อ gdtt-agkkkkkkkga-psay การเข้ารหัส การดัดแปลงโปรตีนใยเป็นวัตถุดิบใน prp2014 ทดแทนเส้นใย ad5 พื้นเมืองและซีเ มวี lacz การแสดงออกเทปเพิ่มแทนการลบ E1 และเขต ad5spklacz .และการรวมตัวของ pca38 prp2014 สร้างการควบคุมไวรัส ad5llacz . นับอนุภาคถูกใช้เพื่อตรวจสอบ titre ของเวกเตอร์เป็นส่วนลงตัวของไวรัสเป็นวิธีเจือจางในบัฟเฟอร์ ( 1 mM EDTA , 0.1 SDS ) อุ่นสำหรับ 20 นาทีที่ 65 ° C และค่ากำหนดเป็น 1 a260 = 1.1 × 1012 อนุภาค


มมูโนบล็การวิเคราะห์เพื่อศึกษาระดับของการรวมตัวกันของ แบบเส้นใยโปรตีนเรา assayed เจือจางของไวรัสหุ้น Hexon ( โหลดการควบคุม ) และเส้นใยสัญญาณโดยมมูโนบล็ . ไวรัสเพื่อลด 109 ไวรัสอนุภาคในทั้งหมด 10 μ L ของ PBS , และรวมที่มีปริมาณเท่ากันของ 2 × SDS / หน้าโปรตีนโหลดบัฟเฟอร์ ( 62.5 มม. โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 6.8 25 % กลีเซอรอล 2% SDS , โบรโมฟีน 0.01 % สีฟ้า , 5% บีตา - mercaptoethanol ) จำนวนต้มเป็นเวลา 5 นาทีและแยกโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน 12 % SDS - polyacrylamide gel . การแยกโปรตีนที่ถูกย้ายไปยังีนไดฟลูออไรด์ ( immobilon-p เยื่อหุ้มเซลล์ , เยื่อแผ่นมิลลิ ) และการตรวจสอบแอนติบอดีต่อโปรตีนแคปซิดมาโฆษณา ( ab6982 , 1 / 10 , 000 ; ABCAM ) หรือเส้นใย ( ms-1027-p0 , 1 / 1 , 000 , neomarkers )