To compare the promoter activities

To compare the promoter activities of KoRV-A and KoRV-J, LTR reporter plasmids containing U3/R region of LTRs from KoRV-A (strain Cindy), KoRV-J (strain OJ-4), and FeLV-B (strain Gardner–Arnstein) were constructed by inserting the U3/R region of LTRs into pGL3 Basic Luciferase Reporter Vector (Promega Corp., Madison, WI, USA), and designated as pGL-KA-LTR, pGL-KJ-LTR and pGL-FB-LTR, respectively. The detailed procedure for the plasmid construction is available on request. As a positive control, pGL3-Control vector (Promega) containing SV40 promoter and enhancer upstream of the luciferase gene was also used (Fig. 1). As an internal control, we used pRL-TK (Promega) containing Renilla luciferase reporter gene under the control of herpes simplex virus 1 thymidine kinase promoter. HEK293 (a human embryonic kidney cel line; ATCC, CRL-1573), PtK2 cells [a long-nosed potoroo (Potorous tridactylis) kidney cell line; ATCC, CCL56], and human lymphoid/myeloid cell lines [Jurkat (acute T cell leukemia; ATCC, TIB-152), Raji (Burkitt’s lymphoma; ATCC, CCL-86), U-937 (histiocytic lymphoma; ATCC, CRL-1593.2), THP1 (acute monocytic leukemia; ATCC, TIB202), and K-562 cells (chronic myelogenous leukemia; ATCC, CCL-243)], were transfected with each reporter plasmid (1.9 μg) and pRL-TK (0.1 μg) by using Amaxa Nucleofector (Lonza Cologne AG, Cologne, Germany) according to the manufacturer’s instructions. The long-nosed potoroo is a small marsupial. Twenty-four hours after transfection, the luciferase activities were measured using a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) with a Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Calmbacher, Bad Wildbad, Germany), according to the manufacturers’ instructions. Transfection efficiency was normalized using the Renilla luciferase activity of pRL-TK in each cell line.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การเปรียบเทียบกิจกรรมโปรโมเตอร์ของ KoRV A และเจ KoRV, LTR โปรแกรมรายงาน plasmids ประกอบด้วยภูมิภาค U3/R LTRs จาก KoRV A (ต้องใช้ดร.ซินดี้), KoRV-เจ (ต้องใช้ OJ-4), และ FeLV B (สายพันธุ์การ์ดเนอร์ – Arnstein) ถูกสร้าง โดยการแทรกแคว้น U3/R LTRs เป็น pGL3 พื้นฐาน Luciferase โปรแกรมรายงานเวกเตอร์ (Promega Corp. เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา), และกำหนด pGL-KA-LTR, pGL KJ LTR และ pGL-FB-LTR ตามลำดับ ขั้นตอนรายละเอียดการก่อสร้าง plasmid ได้ตามคำขอ เป็นตัวควบคุมบวก เวกเตอร์ควบคุม pGL3 (Promega) ที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ SV40 และเพิ่มต้นน้ำของยีน luciferase ถูกใช้ (Fig. 1) เป็นตัวควบคุมภายใน เราใช้ pRL-TK (Promega) ที่ประกอบด้วยยีนโปรแกรมรายงาน luciferase Renilla ภายใต้การควบคุมของเริมไวรัส 1 thymidine kinase โปรโมเตอร์ HEK293 (มนุษย์ตัวอ่อนไต cel บรรทัด ATCC ค.ศ. 1573-ค.ศ. CRL), PtK2 เซลล์ [potoroo เหลืองปากยาว (Potorous tridactylis) ไตเซลล์บรรทัด ATCC, CCL56], และเซลล์มนุษย์ lymphoid ชนิด/ไมอิลอยด์บรรทัด [Jurkat (มะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันเซลล์ T ATCC, TIB-152), Raji (Burkitt ของคอลลา ATCC, CCL-86), U-937 (คอลลา histiocytic ATCC, CRL 1593.2), THP1 (เฉียบพลัน monocytic มะเร็งเม็ดเลือดขาว ATCC, TIB202), และ K-562 เซลล์ (เรื้อรัง myelogenous มะเร็งเม็ดเลือดขาว ATCC, CCL-243)], มี transfected แต่ละโปรแกรมรายงาน plasmid (1.9 μg) และทีเค pRL (0.1 μg) โดย Amaxa Nucleofector (AG Lonza โคโลญจน์ โคโลญ เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต Potoroo เหลืองปากยาว marsupial ขนาดเล็กได้ ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจากการ transfection กิจกรรม luciferase ถูกวัดด้วยระบบโปรแกรมรายงานวิเคราะห์คู่ Luciferase (Promega) Lumat LB9507 (Berthold เทคโนโลยี Calmbacher ดี Wildbad เยอรมนี), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ประสิทธิภาพ transfection ได้ตามปกติโดยใช้กิจกรรม luciferase Renilla ของทีเค pRL ในบรรทัดแต่ละเซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อเปรียบเทียบกิจกรรมก่อการ KoRV-A และ KoRV-J, LTR นักข่าวพลาสมิดที่มีภูมิภาค U3 / R ของ LTRs จาก KoRV-A (สายพันธุ์ซินดี้) KoRV-J (สายพันธุ์ OJ-4) และ FeLV-B (สายพันธุ์การ์ดเนอร์ -Arnstein) ถูกสร้างขึ้นโดยการใส่ U3 / R ภูมิภาค LTRs เข้า pGL3 พื้นฐาน luciferase ผู้สื่อข่าวเวกเตอร์ (Promega คอร์ปแมดิสัน, WI, USA) และกำหนดให้เป็น PGL-KA-LTR, PGL-KJ-LTR และ PGL-FB -LTR ตามลำดับ ขั้นตอนรายละเอียดการก่อสร้างพลาสมิดที่มีอยู่ตามคำขอ เป็นตัวควบคุมบวก pGL3 ควบคุมเวกเตอร์ (Promega) ที่มีผู้ก่อการ SV40 และเพิ่มต้นน้ำของยีน luciferase ยังถูกนำมาใช้ (รูปที่ 1). ในฐานะที่เป็นการควบคุมภายในที่เราใช้ PRL-TK (Promega) ที่มียีน Renilla นักข่าว luciferase ภายใต้การควบคุมของเชื้อไวรัสเริม 1 ก่อการไคเนส thymidine HEK293 (ไตของตัวอ่อนมนุษย์สายเต็มอิ่ม; ATCC, CRL-1573) เซลล์ PtK2 [เป็น potoroo จมูกยาว (Potorous tridactylis) เซลล์ไต; ATCC, CCL56] และมนุษย์ต่อมน้ำเหลือง / เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด [Jurkat (เฉียบพลันเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว T; ATCC, TIB-152) ราจี (โรคมะเร็งต่อมน้ำเหลือง Burkitt ของ; ATCC, CCL-86), U-937 (โรคมะเร็งต่อมน้ำเหลือง histiocytic; ATCC, CRL- 1,593.2) THP1 (เฉียบพลันโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว monocytic; ATCC, TIB202) และ K-562 เซลล์ (มะเร็งเม็ดเลือดขาวเรื้อรัง myelogenous; ATCC, CCL-243)] ถูก transfected กันพลาสมิดนักข่าว (1.9 ไมโครกรัม) และ PRL-TK (0.1 ไมโครกรัม) โดยใช้ Amaxa Nucleofector (Lonza โคโลญ AG, โคโลญ, เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต potoroo จมูกยาวเป็นกระเป๋าขนาดเล็ก ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจาก transfection กิจกรรม luciferase ถูกวัดโดยใช้แบบ Dual-luciferase ผู้สื่อข่าวระบบ Assay (Promega) กับ Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Calmbacher, Bad Wildbad, เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ประสิทธิภาพ transfection ได้ปกติโดยใช้กิจกรรม luciferase Renilla ของ PRL-TK ในแต่ละสายพันธุ์ของเซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเปรียบเทียบการจัดกิจกรรมและ korv-a korv-j , LTR นักข่าวพลาสมิดที่มี U3 R / ภูมิภาคของ ltrs จาก korv-a ( สายพันธุ์ซินดี้ ) korv-j ( oj-4 สายพันธุ์ ( สายพันธุ์ ) และ felv-b การ์ดเนอร์–อาร์นสไตน์ ) ถูกสร้างโดยใส่ U3 R / ภูมิภาคของ ltrs เป็น pgl3 พื้นฐานเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( นักข่าวเวกเตอร์ promega คอร์ป เมดิสัน ใช่ , USA ) และเขต PGL กะ LTR , PGL KJ LTR PGL FB และ LTR ,ตามลำดับ ขั้นตอนรายละเอียดการสร้างพลาสมิดที่มีอยู่เมื่อมีการร้องขอ เป็นตัวควบคุมบวก pgl3 เวกเตอร์ควบคุม ( promega ) ที่มีการเพิ่ม sv40 upstream ของยีนและเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ก็ใช้ ( รูปที่ 1 ) เป็นระบบควบคุมภายในเราใช้ PRL TK ( promega ) ที่มี renilla ลูซิเฟอเรส นักข่าวจีนภายใต้การควบคุมของไวรัสเริม 1 ไทมิดีน ไคเนส โปรโมเตอร์ hek293 ( มนุษย์ตัวอ่อนไต cel บรรทัด และ crl-1573 , ) , ptk2 เซลล์ [ จมูกยาว potoroo ( potorous tridactylis ) สายเซลล์ไต ; ) ccl56 ] , และมนุษย์เซลล์น้ำเหลือง / 10 [ jurkat ( T เซลล์ลูคีเมียเฉียบพลัน เชื้อ tib-152 ; , )ราจิ ( ประเทศเวียดนาม ) ccl-86 Balb ; , ) , ( histiocytic ต่อมน้ำเหลือง ; ) crl-1593.2 , ) , thp1 ( monocytic ลูคีเมียเฉียบพลัน ; ) , , k-562 tib202 ) และเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวเรื้อรังชนิดไมอิลอยด์ ; ) ccl-243 , ) ] , transfected กับนักข่าวแต่ละสายพันธุ์ ( μ 1.9 กรัม ) และฮอร์โมนμ TK ( 0.1 กรัม ) โดยใช้ amaxa nucleofector ( Service Ag โคโลญ , โคโลญ , เยอรมนี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตเกี่ยวกับสัตว์ที่มีกระเป๋าหน้าท้อง potoroo จมูกยาวเป็นขนาดเล็ก ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจากที่ transfection , กิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยใช้เอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( นักข่าว ) สองระบบ promega ) กับ lumat lb9507 ( calmbacher Berthold , เทคโนโลยี , บาด วิลด์บาด , เยอรมนี ) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำประสิทธิภาพสูงใช้สำหรับเป็น renilla ลูซิเฟอเรสติน กิจกรรมของ TK ในแต่ละเซลล์