Subcloning the genes encoding the m

Subcloning the genes encoding the metallopeptidase and response
regulator
The full-length metallopeptidase gene alone (pCRC01), the full-length regulator gene alone
(pCRC03) and the combination of both the metallopeptidase and the regulator gene (pCRC02)
were subcloned in a pET28b (Novagen, Madison, WI) background using primers (Table 2) targeting
XbaI and BamHI restriction enzyme sites (pCRC01, pCRC02), or NcoI and BamHI restriction
enzyme sites (pCRC03) present in the pET28b multicloning region. A Thr to Ala
mutation was introduced at Thr2 in the regulator gene coding sequence in pCRC03 to facilitate
cloning using the NcoI restriction enzyme site.
To construct a system in which the genes present on these constructs would be expressed in
an E. coli strain in the absence of the λDE3 lysogen, a native E. coli promoter (uvrA) was cloned
into each of these constructs using preexisting BglII and XbaI restriction enzyme sites from
their respective pET28b multicloning regions. The cloned promoter DNA was engineered with
these restriction enzyme sites, and was constructed from two synthetic oligonucleotides that
were annealed and digested accordingly (Table 2). This strategy directly added the native
E. coli promoter, displacing the existing T7 promoter region. The newly constructed vectors
were named pCRC01UVRA, pCRC02UVRA, and pCRC03UVRA, according to the notation
introduced in the above paragraph. Verification of expression was performed by SDS-PAGE
analysis of the protein from EPI300 E. coli containing pCRC03UVRA as well as
phenotypic assays.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Subcloning ยีน metallopeptidase และตอบรับการเข้ารหัสเครื่องปรับลมMetallopeptidase ปราศจากยีนเพียงอย่างเดียว (pCRC01), ควบคุมยีนปราศจากคนเดียว(pCRC03) และ metallopeptidase และยีนควบคุม (pCRC02)มี subcloned ในการ pET28b (Novagen เมดิสัน WI) พื้นหลังโดยใช้ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) กำหนดเป้าหมายXbaI และ BamHI เอนไซม์จำกัดเว็บไซต์ (pCRC01, pCRC02), หรือ NcoI และ BamHI จำกัดไซต์เอนไซม์ (pCRC03) ปัจจุบันในภูมิภาค multicloning pET28b Thr ไปอลาการกลายพันธุ์ถูกนำมาใช้ที่ Thr2 ในลำดับรหัสยีนควบคุมใน pCRC03 เพื่ออำนวยความสะดวกโคลนใช้ไซต์เอนไซม์จำกัด NcoIสร้างระบบจะแสดงยีนที่อยู่ในโครงสร้างเหล่านี้ในสายพันธุ์ใน lysogen λDE3 โปรโมเตอร์ภาษา E. coli (uvrA) ของ E. coli ถูกโคลนในแต่ละโครงสร้างเหล่านี้ใช้ไซต์การเอนไซม์จำกัดอิง BglII และ XbaI จากขอบเขตของตนตามลำดับ pET28b multicloning ดีเอ็นเอโคลนโปรโมเตอร์ถูกออกแบบทางวิศวกรรมด้วยเว็บไซต์เหล่านี้เอนไซม์จำกัด และถูกสร้างขึ้นจากสอง oligonucleotides สังเคราะห์ที่annealed และเจ่าตามลำดับ (ตารางที่ 2) กลยุทธ์นี้เพิ่มพื้นเมืองโดยตรงโปรโมเตอร์ e. coli ฎพยัคฆ์ภูมิภาคโปรโมเตอร์ T7 อยู่ เวกเตอร์เพิ่งสร้างใหม่มีชื่อว่า pCRC01UVRA, pCRC02UVRA และ pCRC03UVRA ตามสัญลักษณ์แนะนำในย่อหน้าข้างต้น ทำการตรวจสอบนิพจน์ โดย SDS-หน้าการวิเคราะห์โปรตีนจาก EPI300 E. coli ที่ประกอบด้วย pCRC03UVRA เป็นassays ไทป์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยีนยีนที่ควบคุมการ metallopeptidase

และการเข้ารหัสแบบเต็มตัว metallopeptidase ยีนคนเดียว ( pcrc01 ) , การควบคุมแบบเต็มตัวยีนอยู่คนเดียว
( pcrc03 ) และการรวมกันของทั้งสอง metallopeptidase และการควบคุมยีน ( pcrc02 )
) ของใน pet28b ( novagen เมดิสัน , WI ) พื้นหลังโดยใช้ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 2 ) เป้าหมาย
xbai BamHI และเอนไซม์ ( pcrc01 เว็บไซต์ ,pcrc02 ) หรือ ncoi เอนไซม์ BamHI จำกัด
และเว็บไซต์ ( pcrc03 ) อยู่ใน pet28b multicloning ภูมิภาค เป็นสาให้เอ๋
การกลายพันธุ์แนะนําที่ thr2 ในการเขียนโปรแกรมควบคุมลำดับยีนใน pcrc03 เพื่อความสะดวกในการใช้เอนไซม์ ncoi

เพื่อสร้างระบบเว็บไซต์ ซึ่งในยีนที่อยู่บนโครงสร้างเหล่านี้จะแสดงใน
ตัว Eโคไลสายพันธุ์ในการขาดงานของλ DE3 lysogen การพื้นเมือง , E . coli ( uvra ) ถูกโคลน
ในแต่ละโครงสร้างเหล่านี้ใช้อยู่ bglii xbai เอนไซม์ และเว็บไซต์ของตนจาก
pet28b multicloning ภูมิภาค การโคลนดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์วิศวกรรม
เหล่านี้เว็บไซต์และถูกสร้างขึ้นจากสองที่
โอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ก็อบและย่อยตามลําดับ ( ตารางที่ 2 ) กลยุทธ์นี้โดยตรงเพิ่มพื้นเมือง
E . coli ที่โปรโมเตอร์แทนที่ที่มีอยู่การ * * 3 ) การสร้างใหม่เวกเตอร์
ชื่อ pcrc01uvra pcrc02uvra , และ pcrc03uvra ตามสัญลักษณ์
แนะนำในย่อหน้าข้างต้น การตรวจสอบการแสดงออกโดยใช้การวิเคราะห์เอนไซม์ของโปรตีนจาก epi300
Eจากที่มี pcrc03uvra เช่นเดียวกับ
ฟีโนไทป์ ) .