To better be able to study the biol

To better be able to study the biological role of RoxP, we deleted roxP from P. acnes KPA171202 through mutagenesis according to a recently described protocol29. The deletion of roxP was verified by PCR amplification and sequencing (data not shown). The successful deletion of roxP was further verified by comparing the secreted protein fraction of P. acnes KPA171202 (wildtype) and the mutant strain KPA171202ΔroxP by 2D gel electrophoresis. The prominent protein spot of RoxP in the 2D gel pattern of the secreted proteins of the wildtype strain was absent in the pattern of the ΔroxP-mutant strain (Supplementary Fig. 4).

Next, we investigated the ability of sterile filtered culture supernatants from wildtype and ΔroxP-mutant P. acnes to protect molecules from oxidation. As a proof of principle to study the antioxidant effect of RoxP, we measured the degradation of oxy-hemoglobin incubated with wildtype or ΔroxP-mutant strain-derived supernatants, respectively. Oxidation of hemoglobin results in the degradation thereof, as detected by a decrease of Abs410 nm, while putative antioxidant effects of the supernatant will stabilize hemoglobin and limit degradation. The addition of wildtype supernatant resulted in no visible degradation of hemoglobin over a 5 h time period (Fig. 4c). However, addition of the ΔroxP-mutant supernatant resulted in complete degradation of hemoglobin within 5 h (Fig. 4d), indicating a reduced ability of the ΔroxP-mutant strain to protect the molecule (hemoglobin) from oxidative stress.

RoxP facilitates P. acnes survival in oxic environments in vitro
Other bacterial antioxidant proteins have been suggested to be of importance for oxygen tolerance30. To investigate the importance of RoxP for P. acnes survival in an oxic environment, cultures were grown under anaerobic and aerobic conditions. The ΔroxP-mutant strain had a slightly faster growth curve as compared to the wildtype during anaerobic conditions (Fig. 5a, solid lines), but had a much slower growth during aerobic conditions (Fig. 5a, dashed lines). Likewise, wildtype P. acnes was able to survive in a normal air oxygen environment for an extended period of time, while the ΔroxP-mutant was sensitive to oxygen, with no live bacteria present after six days of incubation (Fig. 5b, solid lines). Addition of free RoxP (0.02 mg/ml) enhanced the initial survival of both the wildtype and the ΔroxP-mutant strains (27 ± 16%, and 20 ± 22%, respectively), but had no lasting effect (Fig. 5b, dashed lines). Though a trend, the increased initial survival upon RoxP supplementation was not statistically significant.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ให้ดีขึ้นสามารถที่จะศึกษาบทบาททางชีวภาพของ RoxP เราลบ roxP จากพีสิว KPA171202 ผ่านฉับตาม protocol29 อธิบายไว้เมื่อเร็ว ๆ นี้ การลบ roxP ได้รับการตรวจสอบโดยการขยาย PCR และลำดับ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) การลบความสำเร็จของ roxP ถูกตรวจสอบต่อไปโดยการเปรียบเทียบส่วนโปรตีนที่หลั่งพีสิว KPA171202 (wildtype) และKPA171202ΔroxPสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์จาก 2D ข่าวคราว จุดโปรตีนที่โดดเด่นของ RoxP ในรูปแบบเจล 2D ของโปรตีนที่หลั่งมาของสายพันธุ์ wildtype ก็ไม่อยู่ในรูปแบบของสายพันธุ์ΔroxPกลายพันธุ์ (เสริมรูปที่. 4).

ต่อไปเราจะตรวจสอบความสามารถในการฆ่าเชื้อ supernatants วัฒนธรรมกรองออกจาก wildtype และΔroxPกลายพันธุ์ P. สิวเพื่อป้องกันโมเลกุลจากออกซิเดชัน ในฐานะที่เป็นหลักฐานของหลักการในการศึกษาผลกระทบของสารต้านอนุมูลอิสระ RoxP เราวัดการย่อยสลายของ Oxy-เฮโมโกลบินบ่มกับ wildtype หรือΔroxPกลายพันธุ์ supernatants สายพันธุ์ที่ได้มาตามลำดับ ออกซิเดชันของฮีโมโกลผลในการย่อยสลายของมันเป็นที่ตรวจพบจากการลดลงของ Abs410 นาโนเมตรในขณะที่ผลกระทบสารต้านอนุมูลอิสระสมมุติใสจะมีเสถียรภาพเลือดและขีด จำกัด ของการย่อยสลาย นอกเหนือจาก wildtype ใสไม่มีผลในการย่อยสลายที่มองเห็นของฮีโมโกลในช่วงเวลาที่ 5 H (รูป. 4C) อย่างไรก็ตามนอกเหนือจากสารละลายΔroxPกลายพันธุ์มีผลในการย่อยสลายสมบูรณ์ของเม็ดเลือดแดงภายใน 5 ชั่วโมง (รูป. 4D) แสดงให้เห็นความสามารถในการลดความเครียดΔroxPกลายพันธุ์เพื่อป้องกันโมเลกุล (ฮีโมโกล) จากความเครียด oxidative.

RoxP อำนวยความสะดวกในพีสิว การอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่ออกซิกในหลอดทดลอง
โปรตีนสารต้านอนุมูลอิสระอื่น ๆ แบคทีเรียได้รับการแนะนำให้ความสำคัญสำหรับ tolerance30 ออกซิเจน เพื่อตรวจสอบความสำคัญของการ RoxP สำหรับพีสิวอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่ออกซิกวัฒนธรรมภายใต้การปลูกแบบไม่ใช้ออกซิเจนและเงื่อนไขแอโรบิก สายพันธุ์ΔroxPกลายพันธุ์มีอัตราการเจริญเติบโตเร็วขึ้นเล็กน้อยเมื่อเทียบกับ wildtype ในช่วงสภาวะไร้ออกซิเจน (รูป. 5A, เส้นทึบ) แต่มีการเจริญเติบโตช้าลงมากในช่วงเงื่อนไขแอโรบิก (รูป. 5A เส้นประ) ในทำนองเดียวกัน wildtype พีสิวก็สามารถที่จะอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่มีออกซิเจนในอากาศปกติสำหรับการขยายระยะเวลาในขณะที่ΔroxPกลายพันธุ์ไวต่อออกซิเจนที่ไม่มีเชื้อแบคทีเรียที่มีชีวิตอยู่ในปัจจุบันหลังจากหกวันของการบ่ม (รูป. 5B, เส้นทึบ ) นอกเหนือจาก RoxP ฟรี (0.02 mg / ml) เพิ่มความอยู่รอดเริ่มต้นของทั้ง wildtype และสายพันธุ์ΔroxPกลายพันธุ์ (27 ± 16% และ 20 ± 22% ตามลำดับ) แต่ไม่มีผลยั่งยืน (รูป. 5b ประ บรรทัด) แม้ว่าแนวโน้มเพิ่มขึ้นอยู่รอดเริ่มต้นเมื่อ RoxP เสริมไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จะต้องสามารถที่จะศึกษาบทบาททางชีวภาพของ roxp เราลบ roxp จากหน้าสิว kpa171202 ผ่านการตามที่เมื่อเร็ว ๆนี้อธิบาย protocol29 . การลบ roxp ถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยการขยาย PCR และการหาลำดับเบส ( ข้อมูลไม่แสดง ) การลบความสําเร็จของ roxp เพิ่มเติม ทดสอบความถูกต้องโดยการเปรียบเทียบเศษส่วนของ P . acnes kpa171202 หลั่งโปรตีน ( wildtype ) และสายพันธุ์สายพันธุ์ kpa171202 Δ roxp โดย 2D เจล จุดที่โดดเด่นของโปรตีน roxp ในรูปแบบ 2D เจลของโปรตีนที่หลั่งจาก wildtype สายพันธุ์ที่ไม่อยู่ในรูปแบบของความเครียดΔ roxp กลายพันธุ์ ( เพิ่มเติมรูปที่ 4 )ต่อไป , เราตรวจสอบความสามารถของวัฒนธรรม supernatants ปลอดเชื้อกรองจาก wildtype Δ roxp กลายพันธุ์ P . acnes และปกป้องโมเลกุลจากออกซิเดชัน เป็นหลักการของการพิสูจน์ เพื่อศึกษาผลของสารต้านอนุมูลอิสระ roxp เราวัดการเสื่อมสภาพของออกซีฮีโมโกลบินบ่มด้วย wildtype หรือΔ roxp กลายพันธุ์สายพันธุ์ที่ได้มา supernatants ตามลำดับ ออกซิเดชันของฮีโมโกลบินในผลลัพธ์ของการย่อยสลายนั้น เท่าที่ตรวจพบ โดยการลดลงของ abs410 นาโนเมตร ในขณะที่ผลของสารต้านอนุมูลอิสระซึ่งจะทำให้วงเงินสูงฮีโมโกลบิน และการย่อยสลาย นอกเหนือจาก wildtype สูงส่งผลให้เกิดการเสื่อมสภาพของฮีโมโกลบินที่มองเห็นได้ไม่มี กว่า 5   H เวลา ( ภาพที่ 4C ) อย่างไรก็ตาม การเพิ่มของΔ roxp กลายพันธุ์สูงมีผลในการย่อยสลายสมบูรณ์ของเฮโมโกลบินภายใน 5   H ( รูป 4D ) แสดงความสามารถที่ลดลงของΔ roxp กลายพันธุ์สายพันธุ์เพื่อปกป้องโมเลกุล ( ฮีโมโกลบิน ) จากความเครียดออกซิเดชันroxp ในการอยู่รอดในสภาพแวดล้อมในการเรียนมากหน้าโปรตีนสารต้านอนุมูลอิสระอื่น ๆแบคทีเรียได้รับการแนะนำเป็นสำคัญสำหรับ tolerance30 ออกซิเจน ศึกษาความสำคัญของ roxp สำหรับ P . acnes การอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่เรียน , วัฒนธรรมที่ปลูกภายใต้สภาพไร้ออกซิเจน . การΔ roxp กลายพันธุ์สายพันธุ์มีเส้นโค้งการเจริญเติบโตเร็วขึ้นเล็กน้อยเมื่อเทียบกับ wildtype ระหว่างเงื่อนไข anaerobic ( รูปที่ 43 , สายแข็ง ) แต่มีการเจริญเติบโตช้ามากในช่วงสภาวะแอโรบิก ( รูปที่ 43 เส้นประ , ) อนึ่ง wildtype P . acnes สามารถอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่อากาศออกซิเจนปกติเป็นระยะเวลานาน ในขณะที่Δ roxp mutant มีความไวต่อออกซิเจน ไม่มีแบคทีเรียที่มีชีวิตปัจจุบันหลังจากหกวันของการบ่ม ( มะเดื่อ 5B สายแข็ง ) นอกจากนี้ roxp ฟรี ( 0.02  มก. / มล. ) เพิ่มการเริ่มต้นของทั้ง wildtype และΔ roxp กลายพันธุ์สายพันธุ์ ( 27  ± ร้อยละ 16 และ 20  ±  22 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ) แต่ไม่มีผลยั่งยืน ( มะเดื่อ 5B เส้นประ , ) แม้ว่าแนวโน้มเพิ่มขึ้นเริ่มต้นการอยู่รอดเมื่อ roxp เสริมอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ