E. coli components for protein synt

E. coli components for protein synthesis in vitro Ribosomes of high activity, polymix buffer, initiation factors IF1, IF2 and IF3, translation factors EF-Tu, EF-Ts, EF-G and RF2, tRNA bulk, tRNAPhe, tRNAIle and overexpressed fMet- tRNAfMet, PheRS, ThrRS and IleRS were prepared as described [9,28]. The tRNAs were further purified by HPLC according to Cayama et al. [29] to aminoacylation activities greater than 80%. [3H]-GDPNP (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) and other nucleotides (Sigma, Stockholm, Sweden) were further purified on a MonoQ column (Amersham Bio- science) as described ([9]; Figure 4a). They were bound to the MonoQ in Buffer A (20 mM Tris-HCl) and eluted with NaCl in buffer B (20 mM Tris-HCl and 1 M NaCl). The Met- Ile-encoding mRNA used to make translocation complexes had the sequence gggcccuuguuaacaauuaaggagguauxxx AUG AUU UAA uugcag(a)21. It contained a strong ribosome- binding site, an open reading frame encoding a Met-Ile dipeptide (capital letters), a stop codon UAA and a poly(A) tail for purification on a poly(dT) column; xxx was either a Thr (acu) or a Phe (uuu) codon. The mRNA encoding the Met-Phe-Thr-Ile tetrapeptide had the open reading frame AUG UUU ACG AUU. The mRNAs were synthesized by T7 RNA polymerase transcription of DNA oligonucleotides. [33P]-labeling of tRNAfMet and mRNAs followed standard protocols (Amersham Bioscience).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

E. coli ส่วนประกอบสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนใน Ribosomes ของกิจกรรมสูง บัฟเฟอร์ polymix เริ่มต้นปัจจัย IF1, IF2 และ IF3 ปัจจัยแปล EF-ทู EF-Ts, EF G และ RF2, tRNA จำนวนมาก tRNAPhe, tRNAIle และ overexpressed fMet-tRNAfMet, PheRS, ThrRS และ IleRS ได้เตรียมไว้เป็นอธิบาย [9, 28] เพิ่มเติม tRNAs ไม่บริสุทธิ์ โดย HPLC ตาม Cayama et al. [29] กิจกรรม aminoacylation มากกว่า 80% [3H] -GDPNP (ซื้อ Amersham, Uppsala สวีเดน) และอื่น ๆ นิวคลีโอไทด์ (ซิก สต็อกโฮล์ม สวีเดน) ถูกเพิ่มเติมบริสุทธิ์ในคอลัมน์ MonoQ (วิทยาศาสตร์ชีวภาพ Amersham) อธิบาย ([9]; รูปที่ 4a) พวกเขาถูกผูกไว้กับ MonoQ ในบัฟเฟอร์การ (20 mM ทริสเรทติ้ง HCl) และ eluted กับ NaCl ในบัฟเฟอร์ B (ทริสเรทติ้ง HCl 20 มม.และ 1 M NaCl) MRNA เม็ท - เมาเข้ารหัสที่ใช้ในการทำสิ่งอำนวยความสะดวกในการสับเปลี่ยนได้ลำดับ gggcccuuguuaacaauuaaggagguauxxx uugcag UAA AUG AUU 21 (a) มันประกอบด้วยไซต์ไรโบโซมผูกแข็งแกร่ง เฟรมอ่านเปิดการเข้ารหัส dipeptide เม็ทเมา (อักษรตัวพิมพ์ใหญ่), รหัสพันธุกรรมหยุด UAA และหาง poly(A) สำหรับฟอกในคอลัมน์ poly(dT) xxx ถูก Thr (acu) หรือรหัสพันธุกรรมเป็นเพ (uuu) เปิดอ่านเฟรม AUG UUU จีบ AUU mRNA รหัส tetrapeptide เม็ทเพ-Thr-เมาได้ MRNAs ถูกสังเคราะห์ โดย T7 อาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส transcription ของดีเอ็นเอ oligonucleotides [33P] -ติดฉลากของ tRNAfMet และ mRNAs ตามโพรโทคอลมาตรฐาน (Amersham ซื้อ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

E. coli ชิ้นส่วนสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนในหลอดทดลองไรโบโซมของกิจกรรมสูงบัฟเฟอร์ polymix ปัจจัยริเริ่ม if1, IF2 และ if3 แปลปัจจัย EF-Tu, EF-Ts, EF-G และ RF2 กลุ่ม tRNA, tRNAPhe, tRNAIle และ overexpressed fMet - tRNAfMet, PheRS, ThrRS และ IleRS ได้จัดทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ [9,28] tRNAs ถูกให้บริสุทธิ์โดยวิธี HPLC ตาม Cayama และคณะ [29] เพื่อ aminoacylation กิจกรรมมากกว่า 80% [3H] -GDPNP (Amersham Bioscience, สวีเดน) และนิวคลีโออื่น ๆ (Sigma, สตอกโฮล์ม, สวีเดน) ถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมเกี่ยวกับคอลัมน์ MonoQ (Amersham วิทยาศาสตร์ Bio-) ตามที่อธิบายไว้ ([9] รูปที่ 4a) พวกเขาถูกผูกไว้กับ MonoQ ในบัฟเฟอร์ (20 mM Tris-HCl) และชะที่มีโซเดียมคลอไรด์ในบัฟเฟอร์ B (20 mM Tris-HCl และ 1 M NaCl) mRNA Met- เข้ารหัส-Ile ใช้ในการทำคอมเพล็กซ์โยกย้ายมีลำดับ gggcccuuguuaacaauuaaggagguauxxx สิงหาคม AUU UAA uugcag (ก) 21 มันมีเว็บไซต์ที่มีผลผูกพัน ribosome- แข็งแรงกรอบการอ่านเปิดการเข้ารหัส dipeptide Met-Ile (ตัวอักษร) หยุด codon UA​​A และโพลี (A) หางสำหรับการทำให้บริสุทธิ์บนโพลี (dT) คอลัมน์; xxx เป็นอย่างใดอย่างหนึ่งที่นั่น (ACU) หรือเพ (uuu) codon mRNA เข้ารหัสเมทเพ-Thr-Ile tetrapeptide มีการอ่านเปิดกรอบสิงหาคม UUU ACG AUU mRNAs ถูกสังเคราะห์โดย T7 RNA polymerase ถอดความของ oligonucleotides ดีเอ็นเอ [33P] -labeling ของ tRNAfMet และ mRNAs ตามโปรโตคอลมาตรฐาน (Amersham Bioscience)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

E . coli ส่วนประกอบสำหรับสังเคราะห์โปรตีนในไรโบโซมที่มีกิจกรรมสูง polymix บัฟเฟอร์เริ่มต้นปัจจัย if1 if2 if3 แปล , และ , ปัจจัย EF tu , EF TS , และ ef-g rf2 ทีอาร์เอ็นเอ trnaphe , กลุ่ม , และ trnaile กับ fmet - trnafmet phers thrrs , และ , ilers เตรียมไว้ [ 9,28 ] การ trnas ได้บริสุทธิ์ โดย HPLC ตาม cayama et al .[ 29 ] aminoacylation กิจกรรมมากกว่า 80% [ 3 ] - gdpnp ( ชาม วิทยาศาสตร์ชีวภาพ Uppsala , สวีเดน ) และคู่อื่น ๆ ( Sigma , สตอกโฮล์ม , สวีเดน ) ให้บริสุทธิ์มากขึ้นใน monoq คอลัมน์ ( ชาม ไบโอ - วิทยาศาสตร์ ) ตามที่อธิบายไว้ ( [ 9 ] ; รูป 4A ) พวกเขาถูกผูกไว้กับ monoq ในบัฟเฟอร์ ( 20 มม. โดย HCl ) และตัวอย่างที่มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ในบัฟเฟอร์ B ( HCl ซึ่ง 20 มม. และ 1 M NaCl )มาใช้เพื่อให้สามารถเข้ารหัสของการเคลื่อนย้ายสารประกอบเชิงซ้อน มีลำดับ gggcccuuguuaacaauuaaggagguauxxx ส.ค. auu uaa uugcag ( ) 21 มันมีแข็งแรงไรโบโซม - มัดเว็บไซต์ที่เปิดอ่านเฟรมเจอในไดเปปไทด์ในกลุ่ม ( ตัวอักษรใหญ่ ) , รหัสหยุด uaa และ poly ( A ) หางเพื่อฟอกบนพอลิ ( DT ) คอลัมน์ ; xxx เป็นทั้งสา ( ACU ) หรือเพ ( uuu ) รหัส .mRNA พบเพ Thr ในเตตระเพปไทด์การเข้ารหัสได้เปิดอ่านกรอบส.ค. uuu ACG auu . รหัสที่ได้จากการถอดรหัสดีเอ็นเอโอลิโกนิวคลีโอไทด์ของ RNA Polymerase * * 3 . [ 33p ] - การติดฉลากและ trnafmet รหัสตามโปรโตคอลมาตรฐาน ( ชาม วิทยาศาสตร์ชีวภาพ )