2.2. Tolerance of LAB isolates to N

2.2. Tolerance of LAB isolates to NaCl, acid and bile salts
Overnight cultures of LAB isolates were inoculated into MRS
broth with various sodium chloride (NaCl) concentrations (1e5%)
and incubated at 37
C for 24 h. Growth was observed with respect
to the control (without NaCl) by measuring the optical densities of
the cultures at 600 nm with the help of a spectrophotometer
(Perkin-Elmer, MA, USA).
Cell pellets from the resulting cultures were suspended separately
in MRS broth at pH2 and 3 and incubated at 37
C for 90 min
and 180 min.
Tolerance of the LAB isolates to bile was tested by suspending
cell pellets from the overnight cultures in MRS with 0.3%, 0.5%, 0.8%,
1%, 1.5% and 1.8% bile salts (Sisco Research Laboratories Private
Limited, India). All cultures were incubated at 37
C for 90 min and
180 min. Growth was monitored as described previously (Tulini,
Winkelstroter, & De Martinis, 2013).
Statistical differences for changes in tolerance potential of the
isolates were determined by one-way ANOVA followed by Tukey
(post-hoc) test for multiple comparisons and P < 0.05 was
considered to be statistically significant. Details are provided in the
relevant figure legends.
2.3. Tolerance of LAB isolates to gastric and intestinal juices
Simulated gastric juicewas prepared by adding 0.3 g pepsin into
a sterile aqueous solution of NaCl (2.05 g/l), KH2PO4 (0.60 g/l), CaCl2
(0.11 g/l) & KCl (0.37 g/l), adjusted to pH2.0. Intestinal juice was
prepared by the addition of 0.1 g trypsin and 1.8 g bile salts into
100ml of a sterile aqueous solution of 1.1 g sodium bicarbonate and
0.2 g sodium chloride at pH8.0 (Bao et al., 2010; Bautista-Gallego,
Arroyo-Lopez, Rantsiou, Jimenez-Diaz, Garrido-Fernandez, &
Cocolin, 2013). After addition of enzymes (pepsin in gastric juice
and trypsin in intestinal juice), both the solutions were passed
through 0.2 mm filter.
Test LAB cultures were separately inoculated into simulated
gastric juice and incubated at 37
C for 3 h in an orbital shaker to
simulate peristaltic movements. Viable counts were determined
from samples withdrawn at 0,1, 2 and 3 h of incubation. After 3 h of
incubation in gastric juice, 1 ml culture was inoculated into 9 ml
simulated intestinal juice and incubated at 37
C. Intestinal transit
tolerance was studied by determining the viable counts of LAB in
intestinal juice withdrawn at 0, 6, 12 and 24 h of incubation.
Statistical differences for changes in transit tolerance of the
isolates were calculated using one-way ANOVA followed by Tukey
(post-hoc) test for multiple comparisons and P < 0.05 was
considered statistically significant.
2.4. Determination of autoaggregation and adhesion ability to
Caco-2 cells
Ability of the LAB isolates to aggregate with each other was
studied and autoaggregation percentage was calculated (Bautista-
Gallego et al., 2013). Tests were done in triplicate, results noted
and each value represented mean ± standard deviation of three
independent readings.
Caco-2 cells used to select adhesive Lactobacillus isolates (Ren
et al., 2014) were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
(DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine
serum, L-glutamine (2 mmol/l), penicillin (100 U/ml) and streptomycin
(100 mg/ml). They were incubated at 37
C & 5% (v/v) CO2.
All components were procured from HiMedia Laboratories, India.
Caco-2 cells (105 cells/ml) were seeded into 24-well tissue culture
plates (Nunc, Germany) and were fully differentiated for 15 days
post-confluence by changing the medium after every 2 days (Ren
et al., 2014). The wells of the culture plates were washed twice
with phosphate buffered saline (PBS) of pH 7.4 to remove the unattached
cells. The number of cells in each well as determined in a
Neubauer chamber was 5  105. LAB culture suspension (109 CFU/
ml in antibiotic-free DMEM) or DMEM solution (control) was then
added into the wells containing Caco-2 cells and incubated at 37
C
for 2 h under 5% CO2. After incubation and washing with PBS,
adherent bacteria were detached with 0.05% trypsin-EDTA
(ethylene diamine tetraacetic acid), serially diluted and enumerated
on MRS agar plates (Ren et al., 2014). This test was repeated
thrice and results expressed as mean ± standard deviation of three
independent readings.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 ความอดทนของแล็บเพื่อแยกโซเดียมคลอไรด์กรดและน้ำดีเกลือ
ค้างคืนวัฒนธรรมของเชื้อ LAB ถูกเชื้อเข้า MRS
น้ำซุปที่มีโซเดียมคลอไรด์ต่างๆ (NaCl) ความเข้มข้น (1e5%)
และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การเจริญเติบโตเป็นที่สังเกตด้วยความเคารพ
ต่อการควบคุม (ไม่มีโซเดียมคลอไรด์) โดยการวัดความหนาแน่นแสงของ
วัฒนธรรมที่ 600 นาโนเมตรด้วยความช่วยเหลือของ spectrophotometer
(เพอร์กินเอลเมอ, MA, USA).
เม็ดมือถือจากวัฒนธรรมที่เกิดขึ้นถูกระงับแยกต่างหาก
ใน MRS น้ำซุปที่ PH2 และ 3 และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 นาที
และ 180 นาที.
ความอดทนของห้องปฏิบัติการที่แยกไปน้ำดีได้รับการทดสอบโดยการระงับ
เม็ดมือถือจากวัฒนธรรมค้างคืนใน MRS 0.3%, 0.5%, 0.8%,
1%, 1.5% และ 1.8% เกลือน้ำดี (Sisco วิจัยห้องปฏิบัติการเอกชน
จำกัด อินเดีย) ทุกวัฒนธรรมถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 นาทีและ
180 นาที การเจริญเติบโตคือการตรวจสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Tulini,
Winkelstroter & De Martinis, 2013).
ความแตกต่างทางสถิติสำหรับการเปลี่ยนแปลงในศักยภาพความอดทนของ
สายพันธุ์ได้รับการพิจารณาโดยหนึ่งใน way ANOVA ตามด้วย Tukey
(โพสต์-hoc) การทดสอบสำหรับการเปรียบเทียบหลายและ P < 0.05
ถือว่าเป็นนัยสำคัญทางสถิติ โดยมีรายละเอียดที่ระบุไว้ใน
ตำนานรูปที่เกี่ยวข้อง.
2.3 ความอดทนของแล็บแยกน้ำผลไม้ในกระเพาะอาหารและลำไส้
จำลอง juicewas กระเพาะอาหารจัดทำขึ้นโดยการเพิ่ม 0.3 กรัมน้ำย่อยลงใน
สารละลายผ่านการฆ่าเชื้อของโซเดียมคลอไรด์ (2.05 g / l) KH2PO4 (0.60 กรัม / ลิตร), CaCl2
(0.11 กรัม / ลิตร) และโพแทสเซียมคลอไรด์ ( 0.37 กรัม / ลิตร) ปรับให้ pH2.0 น้ำผลไม้ในลำไส้ได้รับการ
จัดทำขึ้นโดยนอกเหนือจาก 0.1 กรัม trypsin และ 1.8 กรัมเกลือน้ำดีเข้าไปใน
100ml ของการแก้ปัญหาน้ำหมัน 1.1 กรัมโซเดียมไบคาร์บอเนตและ
0.2 กรัมโซเดียมคลอไรด์ที่ pH8.0 (Bao et al, 2010;. Bautista-Gallego,
อาร์โรโย -Lopez, Rantsiou เมเนซ-ดิแอซ, ฆา-เฟอร์นันเด &
Cocolin, 2013) หลังจากที่เพิ่มขึ้นของเอนไซม์ (เปปซินในน้ำในกระเพาะอาหาร
และ trypsin ในน้ำผลไม้ลำไส้) ทั้งการแก้ปัญหาที่ถูกส่งผ่านไป
ผ่าน 0.2 มมกรอง.
วัฒนธรรมห้องปฏิบัติการทดสอบถูกเชื้อแยกเข้าจำลอง
น้ำย่อยและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมงในเครื่องปั่นโคจรไป
จำลองการเคลื่อนไหว peristaltic นับทำงานได้รับการพิจารณา
จากตัวอย่างถอนที่ 0,1, 2 และ 3 ชั่วโมงของการบ่ม หลังจาก 3 ชั่วโมงของ
การบ่มในน้ำย่อย 1 วัฒนธรรมมิลลิลิตรเป็น 9 มล.
จำลองน้ำในลำไส้และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส การขนส่งลำไส้
อดทนได้ศึกษาโดยการกำหนดนับที่ทำงานในห้องปฏิบัติการใน
น้ำผลไม้ลำไส้ถอนตัวที่ 0, 6, 12 และ 24 ชั่วโมงของการบ่ม.
แตกต่างทางสถิติสำหรับการเปลี่ยนแปลงในความอดทนการขนส่งของ
สายพันธุ์นี้จะถูกคำนวณโดยใช้ทางเดียว ANOVA ตามด้วย Tukey
(โพสต์ -hoc) การทดสอบสำหรับการเปรียบเทียบหลายและ P <0.05
ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ.
2.4 ความมุ่งมั่นของ autoaggregation และความสามารถในการยึดเกาะเพื่อ
Caco-2 เซลล์
ความสามารถของห้องปฏิบัติการที่แยกไปรวมกับคนอื่น ๆ ได้รับการ
ศึกษาและร้อยละ autoaggregation ที่คำนวณได้ (Bautista-
Gallego et al., 2013) การทดสอบได้ทำในเพิ่มขึ้นสามเท่าผลการตั้งข้อสังเกต
และแต่ละค่าตัวแทน±ค่าเฉลี่ยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานในสามของ
การอ่านที่เป็นอิสระ.
Caco-2 เซลล์ใช้ในการเลือกสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัสกาว (Ren
et al. 2014) เป็นที่เลี้ยงใน Dulbecco ของ Modified นกอินทรีขนาดกลาง
(DMEM) เสริม 10% ความร้อนการใช้งานของทารกในครรภ์วัว
ซีรั่ม, L-glutamine (2 มิลลิโมล / ลิตร) ยาปฏิชีวนะ (100 U / ml) และ streptomycin
(100 mg / ml) พวกเขาถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและ 5% (v / v) CO2.
ส่วนประกอบทั้งหมดที่ได้รับการจัดหาจาก HIMEDIA ห้องปฏิบัติการ, อินเดีย.
Caco-2 เซลล์ (105 เซลล์ / มล.) เมล็ดลงใน 24 หลุมเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
แผ่น (Nunc เยอรมนี ) และมีความแตกต่างอย่างเต็มที่เป็นเวลา 15 วัน
หลังการบรรจบกันโดยการเปลี่ยนขนาดกลางหลังจากที่ทุก 2 วัน (Ren
et al., 2014) หลุมของแผ่นวัฒนธรรมครั้งที่สองถูกล้าง
ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) ค่า pH 7.4 เพื่อลบโสด
เซลล์ จำนวนของเซลล์ในแต่ละดีตามที่กำหนดใน
ห้อง Neubauer 5? 105. LAB ระงับวัฒนธรรม (109 CFU /
ml ใน DMEM ยาปฏิชีวนะฟรี) หรือสารละลาย DMEM (ควบคุม) จากนั้นก็
เพิ่มเข้าไปในหลุมที่มี Caco-2 เซลล์และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงภายใต้ CO2 5% หลังจากการบ่มและล้างด้วยพีบีเอส,
แบคทีเรียสานุศิษย์อยู่ห่างกับ 0.05% trypsin-EDTA
(เอทิลีน diamine กรด tetraacetic) ปรับลดลำดับและแจกแจง
บนจาน MRS agar (Ren et al., 2014) การทดสอบนี้ซ้ำ
สามครั้งและผลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานในสามของ
การอ่านที่เป็นอิสระ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . ความอดทนของห้องปฏิบัติการแยกกับเกลือ , กรดและเกลือน้ำดีวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืนของห้องปฏิบัติการเชื้อไอโซเลท .ซุปกับโซเดียมคลอไรด์ ( NaCl ) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ( 1e5 % )บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การตรวจสอบ ด้วยความเคารพเพื่อการควบคุม ( NaCl ) โดยวัดความหนาแน่นของแสงวัฒนธรรมที่ 600 nm ด้วยความช่วยเหลือของวัสดุ( เพอร์กินเอลเมอร์ , MA , USA )จากเซลล์เม็ด ทำให้เกิดวัฒนธรรมถูกพักงาน ต่างหากใน MRS broth ที่ PH2 3 บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 นาทีและ 180 นาทีความอดทนของห้องปฏิบัติการแยกกับน้ำดีถูกทดสอบโดยระงับเซลล์เม็ดจากวัฒนธรรมพักค้างคืนในนาง 0.3% , 0.5 , 0.8 %1% , 1.5% และ 1.8 % เกลือน้ำดี ( Sisco วิจัยห้องปฏิบัติการเอกชนจำกัด อินเดีย ) วัฒนธรรมทั้งหมดถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 นาที180 นาที การตรวจสอบ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( tulini ,winkelstroter & เดอมาร์ตินี่ , 2013 )ความแตกต่างทางสถิติสำหรับการเปลี่ยนแปลงศักยภาพความอดทนของแยกวิเคราะห์โดยใช้ความแปรปรวนทางเดียว ตามด้วยคู่( กระทู้เฉพาะกิจ ) ทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณ และ P < 0.05 คือถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ รายละเอียดไว้ในตำนานตัวเลขที่เกี่ยวข้อง2.3 ความอดทนของกระเพาะอาหารและลำไส้ผลไม้แยกกับแล็บจำลอง juicewas เตรียมกระเพาะอาหารโดยการเพิ่ม 0.3 กรัมเป็นเพพซินเป็นสารละลายปราศจากเชื้อของ NaCl ( 2.05 กรัม / ลิตร ) , kh2po4 ( 0.60 กรัม / ลิตร ) , ผลิต( 0.11 กรัม / ลิตร ) และโพแทสเซียม ( 0.37 กรัม / ลิตร ) , ปรับ ph2.0 . น้ำย่อยในลำไส้ คือเตรียมเพิ่ม 0.1 กรัมและเกลือน้ำดีในรูป 1.8 กรัมอ่อนโยนของสารละลายฆ่าเชื้อ 1.1 กรัม โซเดียมไบคาร์บอเนต และ0.2 กรัมโซเดียมคลอไรด์ที่ ph8.0 ( เปา et al . , 2010 ; Gallego Bautista ,อาร์โรโย โลเปซ , rantsiou , Jimenez Diaz , Garrido เฟอร์นานเดซ และcocolin 2013 ) หลังจากการเติมเอนไซม์ ( น้ำย่อยเปปซินในรูปในน้ำย่อยในลำไส้ ) ทั้งโซลูชั่นผ่านผ่านการกรอง 0.2 มิลลิเมตรห้องปฏิบัติการทดสอบวัฒนธรรมถูกแยกเชื้อจำลองน้ำย่อยในกระเพาะอาหาร และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 ชม. ในการปั่นให้โคจรจำลองการเคลื่อนไหว peristaltic . ได้นับถูกกำหนดจากตัวอย่างที่ถอนที่ 0.1 , 2 และ 3 H ของการบ่ม หลังจาก 3 ชั่วโมงของบ่มในน้ำย่อยในกระเพาะอาหาร 1 ml วัฒนธรรมเป็นเชื้อ 9 มิลลิลิตรจำลองในน้ำและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสในการขนส่งความอดทนศึกษาโดยกำหนดนับได้ของในฝันน้ำย่อยในลำไส้ถอนที่ 0 , 6 , 12 และ 24 ชั่วโมงของการบ่มความแตกต่างทางสถิติสำหรับการเปลี่ยนแปลงในการขนส่ง ความอดทนของไอโซเลต ) คำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ตามด้วยคู่( กระทู้เฉพาะกิจ ) ทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณ และ P < 0.05 คือพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ2.4 . การกำหนด autoaggregation และความสามารถในการยึดเกาะcaco-2 เซลล์ความสามารถของห้องปฏิบัติการแยกรวมกับแต่ละอื่น ๆ คือศึกษาและ autoaggregation ร้อยละคำนวณ ( Bautista -Gallego et al . , 2013 ) สอบเสร็จทั้งสามใบ , ผลกล่าวและแต่ละค่าของส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย±สามอ่านอิสระเซลล์ที่ใช้ในการเลือก caco-2 Lactobacillus กาวไอโซเลต ( เรนet al . , 2014 ) เพาะเลี้ยงในดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง( dmem ) เสริมด้วย 10% fetal bovine inactivated ความร้อนเซรั่ม , Glutamine ( 2 mmol / L ) , เพนนิซิลิน ( 100 U / ml ) และสเตร็ปโตมัยซิน( 100 mg / ml ) พวกเขาถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสและ 5 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) CO2ส่วนประกอบทั้งหมดถูกจัดหาจากห้องปฏิบัติการ , himedia อินเดียcaco-2 ( 105 เซลล์เซลล์ / มิลลิลิตร ) มีเมล็ดเป็น 24 ด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแผ่น ( ขณะนี้ เยอรมนี ) และได้ออกครบ 15 วันโพสต์โดยเปลี่ยนกลางหลังบรรจบทุก 2 วัน ( เรนet al . , 2010 ) บ่อน้ำของวัฒนธรรมจานถูกล้าง 2 ครั้งกับเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( PBS ) pH 7.4 ลบเลยเซลล์ จำนวนเซลล์ในแต่ละดีตามที่กำหนดในนูเบาเออร์ห้อง 5 105 ช่วงล่างแลป ( 109 CFU / วัฒนธรรมมิลลิลิตรในยาปฏิชีวนะฟรี dmem ) หรือ dmem โซลูชั่น ( ควบคุม ) จากนั้นเพิ่มลงในบ่อที่มี caco-2 เซลล์ที่บ่มที่ 37 องศาเซลเซียส2 H ได้ที่ 5% CO2 หลังจากบ่มและซักผ้ากับพีบีเอสพลพรรคแบคทีเรียถูกเดี่ยวกับ EDTA 0.05% ซิน( เอทิลีนไดอะ tetraacetic เป็นกรดเจือจาง และแจกแจง )นางวุ้นในจาน ( เรน et al . , 2010 ) การทดสอบนี้ซ้ำสาม และผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน±สามอ่านอิสระ