To construct the upp-based counters

To construct the upp-based counterselection system for P. mendocina
NK-01 (Fig. 1), a 5-FU resistant strain was constructed initially. Based on
homologous recombination, the chromosomal upp gene was deleted.
The upstream and downstream homologous arm fragments of upp
gene (about 500 bp each) were amplified from the genomic DNA of P.
mendocina NK-01 using DNA polymerase with primers uppUP-F/
uppUP-R and uppDN-F/uppDN-R (Table 2). The up- and downstream
homologous arm fragments were then fused by overlapping PCR. The
overlapping PCR product of up- and downstream fragments was
digested with SacI/HindIII and subsequently ligated into pEX18Tc,
which was digested with the same enzymes, to produce recombinant
plasmid pEX18TcΔupp. The remaining ORF in the deletion plasmid encodes
12 N-terminal and 12 C-terminal amino acids of the intact Upp
protein. P. mendocina NK-01 was transconjugated with E. coli S17-1 harboring
pEX18TcΔupp. The plasmid cannot be autonomously replicated;
therefore, it has to integrate via single crossover homologous recombination
at the targeted chromosome. Positive clones should be TetR
(the plasmid pEX18TcΔupp confers Tet resistance) and CmR
. PCR was
used to analyze the chromosomal structure at the upp locus of the positive
clones, using primers uppOUT-F and uppOUT-R, designed according
to the genome sequence flanking the homologous arms, which
were used in both single- and double-crossover recombinants screen.
The verified single-crossover recombinant was cultured in LB without
antibiotics for more than 20 generations. The cultures were then plated
on LB agar plates containing 75 μg/ml of 5-FU and incubated at 30 °C for
18 h. PCR was used to analyze the chromosomal structure at the upp
locus of several 5-FUR colonies, using primers uppOUT-F and uppOUT-R
and the PCR amplicons were verified by sequencing

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การสร้างระบบตาม upp counterselection P. mendocinaNK-01 (รูป 1), สายพันธุ์ทน 5-FU สร้างขึ้นในขั้นต้น คะแนนเฉลียจากรวมตัวกันเซทจะมี ยีนของโครโมโซม upp ถูกลบชิ้นส่วนแขนเซทจะมี upstream และ downstream ของ uppยีน (ประมาณ 500 bp ละ) ได้ขยายจากดีเอ็นเอออก pmendocina NK-01 ใช้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสกับไพรเมอร์ uppUP-F /uppUP R และ uppDN-F/uppDN-R (ตาราง 2) ขึ้น - และปลายน้ำเซทจะมีแขนเศษถูกแล้วเข้าด้วย PCR ที่ทับซ้อนกัน การPCR ที่ทับซ้อนผลิตภัณฑ์ขึ้นและส่วนปลายมีการย่อยกับ SacI/HindIII และกเดี่ยวมาเป็น pEX18Tcซึ่งถูกย่อยสลาย ด้วยเอนไซม์เดียว การผลิต recombinantplasmid pEX18TcΔupp เข้ารหัส ORF เหลือใน plasmid ลบ12 ขั้ว N และ 12 ขั้ว C กรดอะมิโนของ Upp เหมือนเดิมโปรตีนที่มี P. mendocina NK-01 ถูก transconjugated กับ E. coli S17-1 เก็บงำpEX18TcΔupp Plasmid ไม่สามารถจำลอง อย่างอิสระดังนั้น มีการบูรณาการผ่านการรวมตัวกันเซทจะมีครอสโอเวอร์ที่เดียวที่โครโมโซมเป้าหมาย บวกโคลนควร TetR(ตอบ plasmid pEX18TcΔupp Tet ความต้านทาน) และ CmR. PCR ได้ใช้ในการวิเคราะห์โครงสร้างของโครโมโซมที่ที upp ของขั้วบวกโคลน โดยใช้ไพรเมอร์ uppOUT-F และ uppOUT R ออกแบบตามลำดับจีโนมที่ขนาบแขนเซทจะมี ไปที่ใช้ในจอ recombinants ทั้งเดี่ยว และคู่ไขว้Recombinant ครอสโอเวอร์เดี่ยวตามถูกล้างปอนด์โดยไม่ยาปฏิชีวนะมากกว่า 20 รุ่น วัฒนธรรมถูกชุบแล้วปอนด์บน วุ้นแผ่นที่มี 75 μ/มล.ของ 5-FU และรับการกกที่ 30 ° C สำหรับใช้เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างของโครโมโซมที่ upp 18 h. PCRทีของอาณานิคม 5 ขนหลาย ใช้ไพรเมอร์ uppOUT-F และ uppOUT Rและ PCR amplicons ถูกยืนยัน โดยลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อสร้างระบบ counterselection upp ที่ใช้สำหรับพี mendocina
NK-01 (รูปที่ 1). ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ทนต่อ 5-FU ถูกสร้างขึ้นครั้งแรก ขึ้นอยู่กับการ
รวมตัวกันอีกคล้ายคลึงยีนโครโมโซม upp ถูกลบ.
ต้นน้ำและปลายน้ำชิ้นส่วนแขนคล้ายคลึงกันของ upp
ยีน (ประมาณ 500 bp แต่ละคน) ถูกขยายจากดีเอ็นเอของพี
mendocina NK-01 โดยใช้ดีเอ็นเอโพลิเมอร์กับไพรเมอร์ uppUP-F /
uppUP-R และ uppDN-F / uppDN-R (ตารางที่ 2) ขึ้นและปลายน้ำ
ชิ้นส่วนแขนคล้ายคลึงกันถูกหลอมละลายแล้วโดยวิธี PCR ที่ทับซ้อนกัน
ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ทับซ้อนกันของชิ้นส่วนขึ้นและล่อง
ย่อยด้วย SACI / HindIII และต่อมาผูกเข้า pEX18Tc,
ซึ่งได้รับการย่อยด้วยเอนไซม์เดียวกันในการผลิต recombinant
พลาสมิดpEX18TcΔupp ส่วนที่เหลืออีก ORF ในพลาสมิดลบถอดรหัส
12 N-Terminal และ 12 C ขั้วของกรดอะมิโนเหมือนเดิม Upp
โปรตีน พี mendocina NK-01 ถูก transconjugated กับ E. coli S17-1 เก็บงำ
pEX18TcΔupp พลาสมิดไม่สามารถจำลองแบบอัตโนมัติ;
ดังนั้นจึงมีการรวมตัวกันอีกครั้งผ่านทางเดียวที่คล้ายคลึงกันครอสโอเวอร์
ที่โครโมโซมเป้าหมาย โคลนบวกควรจะ tetr
(พลาสมิดpEX18TcΔuppฟาโรห์ Tet ต้านทาน) และ
CMR PCR ถูก
ใช้ในการวิเคราะห์โครงสร้างของโครโมโซมที่สถานที upp ของบวก
โคลนโดยใช้ไพรเมอร์ uppOUT-F และ uppOUT-R ออกแบบตาม
ลำดับจีโนมขนาบข้างแขนคล้ายคลึงกันซึ่ง
ถูกนำมาใช้ทั้งในโคเดียวและสองครั้งที่ครอสโอเวอร์ หน้าจอ.
ของ Verified recombinant เดียวครอสโอเวอร์ที่ถูกเลี้ยงใน LB โดยไม่ต้อง
ใช้ยาปฏิชีวนะมานานกว่า 20 ชั่วอายุคน วัฒนธรรมที่ถูกชุบแล้ว
ใน LB แผ่นวุ้นที่มี 75 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร 5-FU และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
18 ชั่วโมง PCR ถูกใช้ในการวิเคราะห์โครงสร้างของโครโมโซมที่ upp
สถานทีของหลายอาณานิคม 5 ขนสัตว์โดยใช้ไพรเมอร์ uppOUT-F และ uppOUT-R
และ amplicons PCR ถูกตรวจสอบโดยลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สร้างขึ้นตามระบบ mendocina counterselection Pnk-01 ( รูปที่ 1 ) เป็นสายพันธุ์ที่ทน 5-fu ถูกสร้างขึ้นในครั้งแรก ตามโฮโมโลกัสโครโมโซม recombination ยีนขึ้นเป็นลบและตามน้ำทวนน้ำ และชิ้นส่วนของต้นแขนโฮโมโลกัสยีน ( ประมาณ 500 BP แต่ละ ) ถูกขยายจากดีเอ็นเอของพีmendocina nk-01 โดยใช้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสด้วยไพรเมอร์ uppup-f /และ uppup-r uppdn-f / uppdn-r ( ตารางที่ 2 ) ขึ้น - และท้ายโฮโมโลกัส แขนแตก แล้วผสม โดยซ้อน PCR ที่ที่ทับซ้อนกันและผลิตภัณฑ์ขึ้น - และเศษจากคือตัดด้วยซาซิ / - และต่อมาใน pex18tc ผูก ,ที่ย่อยด้วยเอนไซม์เพื่อผลิตรีคอมบิแนนท์เหมือนกันพลาสมิด pex18tc Δขึ้นไป . เหลือ ORF ในการลบการเข้ารหัสพลาสมิด12 และ 12 ซึ่งกรดอะมิโน กรดอะมิโนของขึ้นไปเหมือนเดิมโปรตีน หน้า mendocina nk-01 คือ transconjugated กับ E . coli s17-1 harboringpex18tc Δขึ้นไป . พลาสมิดที่ไม่สามารถเป็นแบบอัตโนมัติ ;ดังนั้น จึงต้องบูรณาการผ่านการใช้ฟังก์ชันเดียวที่ เช่น โครโมโซม โคลนบวกน่าจะสี่( พลาส pex18tc Δขึ้นไปพระราชทานเครื่องต้านทาน ) และ CMR. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสใช้วิเคราะห์โครงสร้างโครโมโซมที่ต้นโลคัสของบวกโคลน และใช้ไพรเมอร์ uppout-f uppout-r ออกแบบตามการเปรียบเทียบจีโนมลำดับจแขน ซึ่งใช้ในทั้งเดี่ยวและคู่แบบไขว้ recombinants หน้าจอตรวจสอบการเพาะเลี้ยงเดี่ยวในปอนด์โดยไม่ยาปฏิชีวนะมากกว่า 20 รุ่น วัฒนธรรมแล้ว ชุบในอาหารจานที่มีμปอนด์ 75 g / ml 5-fu บ่มที่ 30 ° C สำหรับ18 ชั่วโมง เพื่อใช้วิเคราะห์โครงสร้างโครโมโซมที่ต้น .ความเชื่อของอาณานิคม 5-fur หลาย uppout-f uppout-r ใช้ไพรเมอร์และและ amplicons PCR ได้ถูกตรวจสอบโดยลำดับ