2.3.1 Submerge Fermentation process

2.3.1 Submerge Fermentation process:
For preparation of standard inoculum, those
isolates showed a maximum zone of hydrolysis
were cultured in 20 ml inoculum
medium[composition (g/l):
Carboxymethylcellulose (CMC) 5; Tryptone 2;
KH
2PO
4
4; Na
2HPO44; MgSO
4
.7H2O0.2; CaCl2
.2H2O
0.001; FeSO
4
.7H2O 0.004 and pH adjusted to 7]
individually and incubated at 37 ºC for 24 h where
an average viable count of 2-3.5x10
6
cells /ml
culture was obtained. This was used as inoculum
for the production medium.The composition of
production medium was same as of inoculum
medium except the concentration of
Carboxymethyl cellulose which was 1% instead of
0.5%.
Fermentation was carried out in 250 ml
Erlenmeyer flasks, each containing 100 ml sterile
production medium and inoculated with 5% of
standard inoculums (containing 2-3.5x10
6
cells
/ml). The flasks were incubated at 37
0
C on a rotary
shaker at 150 RPM for 72h.
2.3.2 Preparation of crude enzyme:
After incubation, the cultures were centrifuged at
1600 RPM for 20 min at 4°C and supernatant was
used as a source of crude enzyme. The crude
enzyme solution was utilized for determination of
enzyme activities.
2.4 Cellulase enzyme assay:
Carboxymethylcellulase( CMCase) activity was
estimated using a 1 % solution of
carboxymethlycellulose (CMC) in 0.05 M citrate
buffer (pH 4.8) as substrate. The reaction mixture
contained 1 ml citrate buffer, 0.5 ml of substrate
solution and 1ml of crude enzyme solution. The
reaction was carried out at 45°C for 30 min. The
amount of reducing sugar released in the
hydrolysis was measured by DNSA method.The
Enzyme unit (EU) was determine as the amount of
CMCase required to release 1μmole of reducing
sugar per ml per minute under above assay
condition.
2.5 Protein determination:
Protein concentrations in a crude sample were
determined by using a Folin Lowry method (Lowry
et.al.,1951) with bovine serum albumin (BSA) as a
standard.
2.6 Partial purification of cellulase
enzyme:
2.6.1 Ammonium sulfate precipitation:
About 20 ml of the crude enzyme solution was
saturated by solid ammonium sulfate and the
mixture was left overnight at 4
0
C for precipitation
(Lee et.al.,2008). The precipitates were collected
by centrifugation and dissolved in 10 ml of 50 mM
sodium acetate buffer (pH 5.5).
2.6.2 Dialysis:
For partial purification, enzyme collected after
ammonium sulfate precipitation was dialyzed
against 30mM sodium acetate buffer (pH-5.5) at
4ºC with three changes of buffer (Lee et.al.,2008).
The partially purified sample was assayed for
enzyme activity and protein content.
2.7 Identification of cellulase producing
bacteria:
Potential isolates were tentatively identified by
means of morphological, cultural and biochemical
characterization.
2.7.1 Morphological characterization:
For morphological characterization colonies were
stained by Gram’s staining technique and for
suspected isolates special staining was also
performed included capsule staining and
endospore staining. Motility test was also
performed.
2.7.2 Cultural characterization:
The pure culture of individual isolates were further
characterized, on the basis of their Gram’s
reactivity individual isolate was passed on Nutrient
agar and Mac Conkey’s agar plate and then on
special media. After incubation colony
characteristics were noted.
2.7.3 Biochemical characterization:
Different biochemical tests were analyzed included
Indole test, Methyl red test, Vogues-Proskauer
test, Citrate utilization test, starch hydrolysis,
gelatin liquefaction, nitrate reduction, Catalase
test, Oxidase test, phenylalanine deamination and
sugars fermentation test.
2.8 Optimization of cellulase production:
The optimum parameters were determined for
cellulase production from the efficient isolates.
The cellulase fermentation was carried out at
different ranges of parameters included
temperature, pH, incubation period, substrate
concentration and inoculums size. After
fermentation at different parameters the crude
enzyme sample was collected from each to check
the enzyme activity.
2.8.1 Effect of temperature:
To determine the optimum temperature for
cellulase production, fermentation was carried out
at various temperatures in the range of 25ºC,
35ºC, 45ºC, 55ºC and 65ºC.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3.1 จมลงใต้น้ำหมัก:
สำหรับการเตรียม inoculum มาตรฐาน เหล่า
แยกแสดงโซนสูงสุดของไฮโตรไลซ์
มีอ่างใน 20 ml inoculum
กลาง [องค์ประกอบ (g/l):
Carboxymethylcellulose (CMC) 5 Tryptone 2
KH
2PO
4
4 นา
2HPO44 MgSO
4
.7H2O0.2 CaCl2
.2H2O
0.001 FeSO
4
.7H2O 0.004 และค่า pH ปรับปรุง 7]
แต่ละ และที่ incubated ที่ 37 ºC ใน 24 h
การตรวจนับได้เฉลี่ย 2-3.5 x 10
6
เซลล์ /ml
วัฒนธรรมกล่าว นี้ใช้เป็น inoculum
สำหรับผลิตสื่อการองค์ประกอบของ
สื่อผลิตเดียวกัน ณ inoculum
ปานกลางยกเว้นความเข้มข้นของ
Carboxymethyl เซลลูโลสซึ่ง 1% แทน
0.5%
หมักถูกดำเนินใน 250 ml
Erlenmeyer น้ำ แต่ละที่มี 100 ml ใส่
ผลิตขนาดกลาง และ inoculated ด้วย 5%
inoculums มาตรฐาน (ประกอบด้วย 2-3.5 x 10
6
เซลล์
/ ml) น้ำมี incubated ที่ 37
0
C ในแบบโรตารี่
เชคเกอร์ที่ 150 RPM สำหรับ 72h
2.3.2 การเตรียมเอนไซม์ดิบ:
หลังจากบ่ม วัฒนธรรมถูก centrifuged ที่
1600 RPM สำหรับ 20 นาทีที่ 4° C และ supernatant ถูก
ใช้เป็นแหล่งของเอนไซม์ดิบ ดิบ
โซลูชันเอนไซม์ถูกใช้สำหรับการกำหนด
กิจกรรมเอนไซม์
วิเคราะห์เอนไซม์ Cellulase 2.4:
Carboxymethylcellulase (CMCase) กิจกรรมถูก
ประเมินโดยใช้โซลูชั่น 1% ของ
carboxymethlycellulose (CMC) ในซิเตรต 0.05 M
บัฟเฟอร์ (pH 4.8) เป็นพื้นผิว ผสมปฏิกิริยา
1 ml มีซิเตรตบัฟเฟอร์ 0.5 ml ของพื้นผิว
1ml ของเอนไซม์ดิบและแก้ปัญหา ใน
ปฏิกิริยาที่ดำเนินที่ 45° C สำหรับ 30 นาที ใน
จำนวนลดน้ำตาลออกใน
ไฮโตรไลซ์ถูกวัด โดยวิธี DNSAใน
หน่วยเอนไซม์ (EU) ถูกกำหนดเป็นจำนวน
CMCase ต้องปล่อย 1μmole ลด
น้ำตาลต่อ ml ต่อนาทีภายใต้เหนือวิเคราะห์
เงื่อนไข
2.5 กำหนดโปรตีน:
ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างหยาบได้
กำหนดโดยวิธี Folin Lowry (Lowry
et.al.,1951) กับวัว serum albumin (บีเอสเอ) เป็นการ
มาตรฐาน
2.6 ทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของ cellulase
เอนไซม์:
2.6.1 ฝนซัลเฟตแอมโมเนีย:
เกี่ยวกับ 20 ml ของเอนไซม์ดิบถูก
อิ่มตัว ด้วยของแข็งแอมโมเนียซัลเฟตและ
ส่วนผสมที่เหลือค้างคืนที่ 4
0
C สำหรับฝน
(Lee et.al.,2008) Precipitates ถูกเก็บรวบรวม
โดย centrifugation ml ละลายใน 10 มม. 50
โซเดียม acetate บัฟเฟอร์ (pH 5.5)
2.6.2 หน่วย:
สำหรับฟอกบางส่วน เอนไซม์เก็บหลังจาก
ฝนแอมโมเนียซัลเฟตถูก dialyzed
กับบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 30 มม. (pH 5.5) ที่
4ºC มีการเปลี่ยนแปลงสามบัฟเฟอร์ (Lee et.al.,2008)
ตัวอย่างบริสุทธิ์บางส่วนถูก assayed สำหรับ
เนื้อหากิจกรรมและโปรตีนของเอนไซม์
2รหัส 7 cellulase ผลิต
แบคทีเรีย:
แยกอาจเกิดขึ้นได้อย่างไม่แน่นอนระบุ
สัณฐาน วัฒนธรรม และชีวเคมี
จำแนก
จำแนกสัณฐาน 2.7.1:
สำหรับจำแนกสัณฐาน อาณานิคมถูก
สีเทคนิคการย้อมสีของกรัม และใน
สงสัยแยกย้อมสีพิเศษยังเป็น
ทำย้อมสีแคปซูลรวม และ
endospore ย้อมสี การทดสอบ motility ยัง
ทำ
จำแนกวัฒนธรรม 2.7.2:
วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแต่ละแยกมีเพิ่มเติม
ลักษณะ ตามกรัมของ
เกิดปฏิกิริยาแต่ละแยกถูกส่งผ่านในระบบ
agar และแผ่น Mac Conkey agar แล้วบน
สื่อพิเศษ หลังจากบ่มอาณานิคม
ลักษณะที่สังเกต
จำแนก 2.7.3 ชีวเคมี:
ทดสอบชีวเคมีต่าง ๆ ถูกวิเคราะห์รวม
อินโดลทดสอบ ทดสอบ Methyl แดง Vogues Proskauer
ทดสอบ ทดสอบใช้ซิเตรต แป้งไฮโต รไลซ์,
ตุ๋น liquefaction ไนเตรตลด Catalase
ทดสอบ ทดสอบ Oxidase, phenylalanine deamination และ
ทดสอบหมักน้ำตาล
2.8 เพิ่มประสิทธิภาพผลิต cellulase:
พารามิเตอร์เหมาะสมถูกกำหนดสำหรับ
ผลิต cellulase จากแยกมีประสิทธิภาพ
หมัก cellulase ถูกดำเนินการที่
ช่วงต่าง ๆ ของพารามิเตอร์รวม
อุณหภูมิ pH ระยะฟักตัว พื้นผิว
ขนาดความเข้มข้นและ inoculums หลังจาก
หมักที่แตกต่างกันพารามิเตอร์ดิบ
ตัวอย่างเอนไซม์รวบรวมจากการตรวจสอบ
กิจกรรมเอนไซม์
2.8.1 ผลของอุณหภูมิ:
การกำหนดอุณหภูมิเหมาะสมสำหรับ
cellulase ผลิต ทำออกหมัก
ที่อุณหภูมิต่าง ๆ ในช่วงของ 25ºC,
35ºC, 45ºC, 55ºC และ 65ºC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3.1 ากระบวนการหมัก :
สำหรับการเตรียมเชื้อมาตรฐาน พบสูงสุดที่
แยกโซนของการย่อยสลายอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อใน 20 ml

กลาง [ องค์ประกอบ ( กรัม / ลิตร ) :
ผู้ป่วยใน ( CMC ) 5 ; ทริพโทน 2 ;
4
4 2po KH

; na

4 2hpo44 ; MgSO

7h2o0.2 ; CaCl2
. 2H2O-dx
0.001 ; FeSO
4
7h2o 0.004 และการปรับ pH 7 ]
เป็นรายบุคคลและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่º
เฉลี่ยได้นับ 2-3.5x10
6

เลี้ยงเซลล์ / มิลลิลิตร ) นี้ถูกใช้เป็นกล้าเชื้อสำหรับอาหาร

กลางผลิต องค์ประกอบของการผลิตเช่นเดียวกับปริมาณปานกลาง ยกเว้นปริมาณ

คาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลสซึ่งเป็น 1% แทน
0.5 %
หมักได้ดําเนินการใน 250 ml
เออร์เลนเมเยอร์ขวดแต่ละที่มีเป็นหมัน
100 มล.การผลิตขนาดกลางและหัวเชื้อ 5 %
18 ชั่วโมงมาตรฐาน ( ที่มี 2-3.5x10
6

เซลล์ / มิลลิลิตร ) ขวดอุณหภูมิ 37
0
c บนเครื่องปั่นหมุนที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 72h
.
2.3.2 การเตรียมเอนไซม์ :
หลังจากบ่ม , วัฒนธรรมที่เป็นระดับที่
1600 รอบต่อนาที 20 นาทีที่ 4 ° C และนำคือ
ใช้เป็นแหล่งของเอนไซม์ . โดย
สารละลายเอนไซม์ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส
.
2.4 เอนไซม์โดย :
carboxymethylcellulase ( CMCase ) กิจกรรม
วิธีสารละลาย 1 %
carboxymethlycellulose ( CMC ) ใน 0.05 M
ซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 4.8 ) เป็นสับสเตรท ปฏิกิริยาผสม
มีบัฟเฟอร์ซิเทรต 1 มิลลิลิตรของสารละลายและ 0.5 มล. (
1ml ของสารละลายเอนไซม์ดิบ
ปฏิกิริยาดำเนินการที่ 45 ° C เป็นเวลา 30 นาที ปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์

ปล่อยเอนไซม์ถูกวัดโดยวิธี dnsa หน่วย
เอนไซม์ ( EU ) คือกำหนดเป็นจํานวน
23 ต้องปล่อย 1 μโมลลดน้ำตาลต่อมิลลิลิตรต่อนาที

ข้างบน ) ภายใต้เงื่อนไข 2.5 กำหนด :

โปรตีนความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างดิบถูก
กำหนดโดยใช้วิธี folin เบส ( เบส
และคณะ . 1951 ) อัลบูมิน ( BSA ) เป็นมาตรฐาน
.
2.6 การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของเอนไซม์เซลลูเลส
: :

ดูแลแอมโมเนียมซัลเฟตตกตะกอนประมาณ 20 มิลลิลิตรเอนไซม์ในสารละลายแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวด้วย

ผสมแข็งและทิ้ง คืนที่ 4
0
C สำหรับการตกตะกอน
( ลี และคณะ , 2551 ) โดยการเก็บรวบรวมตะกอน
โดยการปั่นเหวี่ยงและละลายใน 10 ml 50 mm
โซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ pH 5.5 ) ดาวน์โหลด :

ไตสำหรับการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของเอนไซม์ , เอนไซม์เก็บหลังจาก
แอมโมเนียม ซัลเฟตตกตะกอนคือซิ
กับ 30mm โซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ ( ph-5.5 )
4 º C สามการเปลี่ยนแปลงของบัฟเฟอร์ ( ลี และคณะ , 2551 )

ตัวอย่างซีรั่มบริสุทธิ์บางส่วนสำหรับเอนไซม์และโปรตีน .
2 .การจำแนกชนิดของแบคทีเรียผลิตเซลลูเลส 7
:
ศักยภาพไอโซเลทสามารถระบุ
หมายถึงลักษณะทางวัฒนธรรมและทางชีวเคมี
ตัวละคร โดย :

การพักการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาลักษณะสำหรับอาณานิคมถูก
คราบกรัมเป็นเทคนิคการย้อมสีและ
สงสัยสายพันธุ์พิเศษด้วยการย้อมติด

รวมชนิดแคปซูลเอนโดสปอร์ staining ทดสอบการเคลื่อนที่ยัง
แสดง คุณสมบัติ :

2.7.2 วัฒนธรรมวัฒนธรรมแท้ของแต่ละไอโซเลท
ลักษณะเพิ่มเติมบนพื้นฐานของพวกเขาคือการแยกเป็นแต่ละกรัม

ส่งต่อ NUMB3RS และแมคค กี การ์จานแล้ว
สื่อพิเศษ หลังจากบ่มอาณานิคม
ลักษณะเป็นอักษรไทย คุณสมบัติ :

2.7.3 ชีวเคมีการทดสอบทางชีวเคมีต่าง ๆมาวิเคราะห์รวม
ทดสอบอินโดล เมทิลทดสอบสีแดง โวเกส proskauer
ทดสอบ ใช้ทดสอบการย่อยแป้งซิ , , เจลาติน ,
, การลดไนเตรท , Catalase
ทดสอบโดยทดสอบ - ฟีนิลอะลานีนและ
น้ำตาลหมักทดสอบ
2.8 เพิ่มประสิทธิภาพการผลิตเซลลูเลส :

หาพารามิเตอร์ที่เหมาะสมสำหรับประสิทธิภาพการผลิตเซลลูเลสจากเชื้อ

เซลหมักได้ดําเนินการในช่วงที่แตกต่างกันของพารามิเตอร์รวม
อุณหภูมิ , ระยะเวลาที่ pH , ความเข้มข้นของสารอาหาร
และขนาด 18 ชั่วโมง หลังจากหมักที่แตกต่างกันพารามิเตอร์ดิบ

จากการเก็บตัวอย่างจากแต่ละคนเพื่อตรวจสอบ
แอคติวิตีของเอนไซม์ ผลของอุณหภูมิ :

2.8.1ศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับ
การผลิตเซลลูเลส การหมักโดยใช้
อุณหภูมิต่างๆ ในช่วง 25 º C ,
3 º C 45 º C 55 º c 65 º C