Supercoiled plasmidSupercoiled DNA

Supercoiled plasmid
Supercoiled DNA is the native confirmation found in vivo and occurs when extra twists are introduced into the double helix strand. People often compare the forms of DNA to rubber bands or telephone cords (I know some you must still remember phones with cords!). If you over twist a rubber band or telephone cord, coils stack up upon one another introducing tension. In the case of a plasmid, this superhelical tension cannot be relieved because the ends of the plasmid are joined together. Supercoiled DNA migrates faster than predicted in an agarose gel due to its conformation. Supercoiled DNA is the desired species when isolating plasmid DNA.

Nicked, relaxed circular plasmid
DNA found in the supercoiled form is not easily accessed by replication machinery. During replication, cellular topoisomerases nick one strand of the DNA helix and relax the superhelical tension, thus allowing polymerases to gain access to the DNA. Using the rubber band analogy, nicked circle DNA would be the rubber band without any twists introduced. This large floppy circle is the slowest migrating form in an agarose gel.

Linear plasmid
Linearized DNA occurs when the DNA helix is cut in both strands at the same place. Linear DNA generally migrates between the nicked circle and the supercoiled forms. However, it may also migrate the same distance as nicked circle — it migrates as predicted by the length of the DNA (as compared to the MW markers). The linear DNA form is easily identified on an agarose gel by comparing uncut plasmid DNA with a sample of the plasmid that has been linearized using a restriction enzyme. If you get linear DNA when you are hoping for supercoiled (e.g. after a plasmid prep) it is due to nuclease contamination or harsh treatment during purification.

Circular, single stranded plasmid
During alkaline lysis, plasmids are denatured because the hydrogen bonds are disrupted by the alkaline conditions. But the covalently-closed circular strands remain intact and topologically constrained and when the pH is returned to neutral the hydrogen bonds reform and the supercoiled DNA is re-formed. However, if the alkaline lysis step is overly harsh (e.g. it is incubated for too long) the DNA can become permanently denatured and give you useless single stranded closed circles that migrate ahead of all of the other forms of the plasmid in a gel. For a full description of how alkaline lysis works, click here.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Supercoiled พลาสมิด
ดีเอ็นเอ Supercoiled คือการยืนยันพื้นเมืองที่พบในร่างกายและเกิดขึ้นเมื่อบิดพิเศษจะนำเข้าสู่สาระเกลียวคู่ คนมักจะเปรียบเทียบรูปแบบของดีเอ็นเอกับวงยางหรือสายโทรศัพท์ (ฉันรู้ว่าบางอย่างที่คุณยังคงต้องจำโทรศัพท์พร้อมสาย) หากคุณมากกว่าบิดยางรัดหรือสายโทรศัพท์, ขดลวดกองขึ้นอยู่กับอีกคนหนึ่งแนะนำความตึงเครียด ในกรณีที่มีพลาสมิดนี้ความตึงเครียด superhelical ไม่สามารถโล่งใจเพราะปลายของพลาสมิดที่มีร่วมกัน ดีเอ็นเอ Supercoiled ย้ายได้เร็วกว่าที่คาดการณ์ไว้ในเจล agarose เนื่องจากโครงสร้างของมัน ดีเอ็นเอ Supercoiled เป็นสายพันธุ์ที่ต้องการเมื่อแยกดีเอ็นเอพลาสมิด. แหว่ง, พลาสมิดที่ผ่อนคลายวงกลมดีเอ็นเอที่พบในรูปแบบที่ไม่ได้ supercoiled เข้าถึงได้ง่ายโดยการจำลองแบบเครื่องจักร ในระหว่างการจำลองแบบ topoisomerases โทรศัพท์มือถือกรงขังเส้นหนึ่งของดีเอ็นเอเกลียวและผ่อนคลายความตึงเครียด superhelical จึงช่วยให้ polymerases เพื่อให้เข้าถึงดีเอ็นเอ การเปรียบเทียบการใช้ยางรัดดีเอ็นเอวงกลมแหว่งจะเป็นแถบยางโดยไม่ต้องบิดแนะนำใด ๆ ฟลอปปี้นี้วงกลมขนาดใหญ่เป็นรูปแบบการโยกย้ายที่ช้าที่สุดในเจล agarose. เชิงเส้นพลาสมิดดีเอ็นเอ Linearized เกิดขึ้นเมื่อเกลียวดีเอ็นเอที่ถูกตัดในเส้นทั้งในสถานที่เดียวกัน ดีเอ็นเอเชิงเส้นโดยทั่วไปย้ายระหว่างวงกลมแหว่งและรูปแบบ supercoiled แต่ก็ยังอาจย้ายระยะทางเดียวกันเป็นวงกลมแหว่ง - มันย้ายเป็นที่คาดการณ์โดยความยาวของดีเอ็นเอ (เมื่อเทียบกับเครื่องหมายเมกะวัตต์) รูปแบบเชิงเส้นดีเอ็นเอระบุได้อย่างง่ายดายบน agarose เจลโดยการเปรียบเทียบดีเอ็นเอพลาสมิดเจียระไนด้วยตัวอย่างของพลาสมิดที่ได้รับการเชิงเส้นโดยใช้เอนไซม์ จำกัด ถ้าคุณได้รับดีเอ็นเอเชิงเส้นเมื่อคุณกำลังหวัง supercoiled (เช่นหลังจากที่เตรียมพลาสมิด) เป็นเพราะ Nuclease การปนเปื้อนหรือการรักษาที่รุนแรงในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์. วงกลม, พลาสมิดที่ควั่นเดียวในระหว่างการสลายด่างพลาสมิดที่มีเอทิลแอลกอฮอล์เพราะพันธะไฮโดรเจนจะหยุดชะงักโดย เงื่อนไขอัลคาไลน์ แต่เส้นวงกลม covalently ปิดยังคงเหมือนเดิมและทอพอโลยี จำกัด และเมื่อค่า pH ถูกส่งกลับไปที่เป็นกลางปฏิรูปไฮโดรเจนพันธบัตรและดีเอ็นเอ supercoiled จะเกิดขึ้นอีกครั้ง แต่ถ้าขั้นตอนสลายด่างรุนแรงมากเกินไป (เช่นมันจะถูกบ่มเป็นเวลานานเกินไป) ดีเอ็นเอจะกลายเป็นแปลงสภาพอย่างถาวรและให้คุณไร้ประโยชน์ปิดควั่นวงการเดียวที่ย้ายไปข้างหน้าของทุกรูปแบบอื่น ๆ ของพลาสมิดในเจล สำหรับรายละเอียดของการทำงานวิธีการสลายด่างคลิกที่นี่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

supercoiled พลาสมิดดีเอ็นเอยืนยัน
supercoiled พื้นเมืองที่พบในสิ่งมีชีวิต และเกิดขึ้นเมื่อบิดเสริมเข้าไปในเกลียวเกลียวคู่ . ผู้คนมักเปรียบเทียบรูปแบบของดีเอ็นเอหนังยางหรือโทรศัพท์สาย ( ผมรู้ว่าคุณต้องจำโทรศัพท์ด้วยสาย ! ) ถ้าคุณบิดยางหรือสายโทรศัพท์ม้วนกองขึ้นเมื่อหนึ่งอื่นแนะนําแรงในกรณีของสายพันธุ์นี้ superhelical ความตึงเครียดไม่สามารถโล่งใจเพราะปลายของพลาสมิดมีร่วมกัน . supercoiled ดีเอ็นเอย้ายเร็วขึ้นกว่าที่คาดการณ์ในเจล ( เนื่องจากมีโครงสร้าง supercoiled ดีเอ็นเอเป็นชนิดที่ต้องการเมื่อแยกพลาสมิดดีเอ็นเอ .

แหว่งผ่อนคลายวงกลมพลาส
ดีเอ็นเอที่พบในรูปแบบ supercoiled ไม่เข้าถึงได้อย่างง่ายดายได้ โดยเครื่องจักรซ้ำในระหว่างการ topoisomerases มือถือ , นิค หนึ่งเกลียวของดีเอ็นเอ และผ่อนคลายความตึงเครียด superhelical จึงช่วยให้ polymerases เข้าถึง DNA ใช้หนังยางอุปมาแหว่งวงกลมดีเอ็นเอจะเป็นยางไม่มีบิดแนะนำ ปี้นี้เป็นวงกลมขนาดใหญ่ที่สุดไปยังแบบฟอร์มในเจล


เส้นพลาสมิดดีเอ็นเอ เกิดขึ้นเมื่อช่วงเกลียวดีเอ็นเอที่ถูกตัดในทั้งสองเส้นในสถานที่เดียวกัน ดีเอ็นเอเชิงเส้นทั่วไปย้ายระหว่างวงกลมแหว่ง และ supercoiled แบบฟอร์ม อย่างไรก็ตาม ก็ยังอาจจะโยกย้ายระยะทางเดียวกันเป็นวงกลมแหว่งมันย้ายตามที่คาดไว้ โดยความยาวของ DNA ( เมื่อเทียบกับ MW เครื่องหมาย )รูปแบบดีเอ็นเอเส้นได้อย่างง่ายดายระบุบนเจล โดยเปรียบเทียบ plasmid DNA เจียระไนที่มีตัวอย่างของพลาสมิดที่ได้รับช่วงการใช้เอนไซม์ . ถ้าคุณได้รับดีเอ็นเอเชิงเส้น เมื่อคุณจะหวัง supercoiled ( เช่นหลังจากเตรียมพลาสมิด ) มันเกิดจากการปนเปื้อนหรือการรักษาที่รุนแรงระหว่างนิวเคลียสบริสุทธิ์

วงกลม เดี่ยวติดพลาสมิด
ในระหว่างการสลายด่าง ,เพื่อจะเกิดเนื่องจากพันธะไฮโดรเจนจะหยุดชะงักโดยสภาวะด่าง แต่ covalently ปิดวงกลมเส้นยังคงเหมือนเดิมและ topologically คงที่และเมื่อพีเอชเป็นกลางคืนไฮโดรเจนพันธบัตรการปฏิรูปและ supercoiled ดีเอ็นเอเป็นรูปแบบ อย่างไรก็ตาม หากขั้นตอนการสลายด่างสุดเหวี่ยงที่รุนแรง ( เช่นมันบ่มนานเกินไป ) DNA สามารถกลายเป็นใช้อย่างถาวร และให้คุณประโยชน์เดียวเกลียวปิดวงกลมที่อพยพล่วงหน้าทั้งหมดของรูปแบบอื่น ๆของพลาสมิดในเจล สำหรับรายละเอียดของวิธีการสลายเป็นด่างงานคลิกที่นี่