2.8. Assay of tyrosinase activity i

2.8. Assay of tyrosinase activity in B16F10 murine melanoma cells
The tyrosinase inhibitory activity was measured using the
method developed by Peng et al. (2013). The B16F10 cells were
cultured in culture flasks in a CO2 incubator in a humidified atmosphere
containing 5% CO2 in air at 37 ◦C, and supplemented with
10% fetal bovine serum (Sigma, USA). The cells (106 cells/mL) were
then harvested through trypsinization and washed 3 times with ice
cold phosphate-buffered saline. Next, the cells were disrupted by
sonication at 4 ◦C and separated by centrifugation at 15,000 rpm for 25 min. The reaction mixtures containing the herb extracts,
2 mg/mL l-DOPA, and a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)
were incubated on a 96-well plate at 37 ◦C for 2 h. After quantifying
protein contents and adjusting concentrations with lysis buffer
until each lysate contained the same amount of protein (40 g). The
activity of mammalian tyrosinase used in the studies was diluted
to 350 units per milliliter, which was the same as that of the mushroom
tyrosinase. The test sample at a concentration of 500 g/mL
was selected to evaluate tyrosinase inhibition in the B16F10 murine
melanoma cells. Absorbance was measured at 450 nm using an
ELISA plate reader.
2.9. The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide assay
The cytotoxicity effect of the fermented herb extracts
was determined with the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. In the MTT assay,
succinate dehydrogenase mitochondrial activity is measured as
an indicator of cell viability and proliferation. In this study, the
cell viability assay was modified from that reported by Wodnicka
et al. (2000). The CCD-966SK and B16F10 cells were counted using
a hemocytometer. After incubation overnight, the cells (5 × 106
cells/well) were washed using a fresh medium and treated with
the vehicle control (culture medium) or fermented herb extracts
for 72 h at different concentrations. The cells were then incubated
with 1 g/l of the MTT solution (0.05 mL) for 4 h in dark at 37 ◦C in
a 5% CO2 incubator. Next, the medium was carefully discarded,
and 0.1 mL of DMSO was added to solubilize the mixture. After
a 10-min reaction, the absorbance of the samples was measured
at 540 nm using a microplate reader (Plate Chameleon V, Hidex,
Finland). The amount of viable cells after each treatment was
expressed as the percentage of the control.
2.10. Statistical analysis
All tests were performed in triplicate. Analysis of variance and
significant difference tests were performed using SPSS (version
15.0) for Windows. Mean differences were considered significant
when P < 0.05.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.8. วิเคราะห์กิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ murine melanoma B16F10กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสซึ่งวัดได้โดยใช้การวิธีพัฒนาโดย Peng et al. (2013) เซลล์ B16F10ล้างในขวดวัฒนธรรมในตู้อบมี CO2 ในบรรยากาศณอุณหภูมิที่ประกอบด้วย 5% CO2 ในอากาศที่ 37 ◦C และเสริมด้วย10% ทารกวัวซีรั่ม (ซิกม่า สหรัฐอเมริกา) เซลล์ (106 เซลล์/มิลลิลิตร)จากนั้นเก็บเกี่ยวผ่าน trypsinization และล้าง 3 ครั้ง ด้วยน้ำแข็งน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์เย็น ถัดไป เซลล์ถูกแทรกแซงด้วยsonication ที่ 4 ◦C และแยก โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 rpm 25 นาที สารสกัดจากสมุนไพรที่ประกอบด้วยส่วนผสมปฏิกิริยาl 2 mg/mL-DOPA และ 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0)ได้รับการกกบนจานหลุม 96 ที่ 37 ◦C สำหรับ 2 h หลังจากเชิงปริมาณโปรตีนเนื้อหาและปรับความเข้มข้นกับ lysis บัฟเฟอร์จนละ lysate อยู่กันของโปรตีน (40 กรัม) การการเลี้ยงลูกด้วยนมเนสมาใช้ในการศึกษาถูกเจือจางหน่วย 350 ต่อมิลลิเมตร ซึ่งเหมือนกับของเห็ดดี ตัวอย่างทดสอบที่ความเข้มข้น 500 กรัม/มล.เลือกการประเมินการยับยั้งไทโรซิเนสใน B16F10 murineมีเซลล์ melanoma โดยวัดค่าที่ 450 nm โดยใช้การอ่านแผ่น ELISA2.9. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumทดสอบโบรไมด์สารสกัดจากผลพิษของสมุนไพรหมักกำหนด ด้วยการ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium โบรไมด์ (MTT) assay ในทดสอบ MTTกิจกรรมยลพร่อง succinate มีวัดเป็นตัวบ่งชี้ของเซลล์ชีวิตและการแพร่กระจาย ในการศึกษานี้ การทดสอบเซลล์ชีวิตล่าสุดจากที่รายงาน โดย Wodnickaet al. (2000) นับเซลล์ CCD 966SK และ B16F10 ใช้hemocytometer หลังจากบ่มข้ามคืน เซลล์ (5 × 106เซลล์/ดี) ถูกซัดใช้สดกลาง และรับการรักษาด้วยควบคุมยานพาหนะ (วัฒนธรรมกลาง) หรือสารสกัดจากสมุนไพรหมักสำหรับ h 72 ที่ความเข้มข้นแตกต่างกัน เซลล์ได้รับการกกแล้วกับ 1 g/l ของสารละลาย MTT (0.05 มิลลิลิตร) สำหรับ 4 h ในมืดที่ ◦C 37 ในตู้อบ 5% CO2 ที่ ถัดไป สื่ออย่างระมัดระวังถูกทิ้งและ 0.1 mL ของ DMSO ถูก solubilize ส่วนผสม หลังจากโดยวัดปฏิกิริยา 10 นาที ค่าตัวอย่างที่ 540 nm ใช้อ่าน microplate (แผ่นกิ้งก่า V, Hidexฟินแลนด์) จำนวนของเซลล์ทำงานได้หลังจากการรักษาแต่ละแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม2.10. สถิติวิเคราะห์ลข้อถูกทดสอบทั้งหมด การวิเคราะห์ความแปรปรวน และการทดสอบความแตกต่างดำเนินการใช้ SPSS (รุ่น15.0) สำหรับ Windows ความแตกต่างหมายถึงการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญเมื่อ P < 0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.8 การทดสอบของกิจกรรมในไทโรซิเน B16F10 เซลล์เนื้องอกหมา
กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนวัดโดยใช้
วิธีการพัฒนาโดย Peng, et al (2013) เซลล์ B16F10 ถูก
เพาะเลี้ยงในขวดวัฒนธรรมในศูนย์บ่มเพาะ CO2 ในบรรยากาศความชื้น
ที่มี CO2 ในอากาศ 5% ที่ 37 ◦Cและเสริมด้วย
ซีรั่ม 10% ของทารกในครรภ์วัว (Sigma, สหรัฐอเมริกา) เซลล์ (106 เซลล์ / มิลลิลิตร) ถูก
เก็บเกี่ยวแล้วผ่าน trypsinization และล้าง 3 ครั้งกับน้ำแข็ง
เย็นน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ถัดไปเซลล์ที่ถูกรบกวนด้วย
sonication ที่ 4 ◦Cและคั่นด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 25 นาที ผสมปฏิกิริยาที่มีสารสกัดจากสมุนไพร,
2 mg / ml L-DOPA และฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 M โซเดียม (pH 7.0)
ถูกบ่มบนแผ่น 96 หลุมที่ 37 ◦Cเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากที่ปริมาณ
โปรตีนและการปรับระดับความเข้มข้นที่มีบัฟเฟอร์สลาย
จนแต่ละ lysate มีจำนวนเดียวกันของโปรตีน (40 กรัม)
กิจกรรมของเอนไซม์ tyrosinase เลี้ยงลูกด้วยนมที่ใช้ในการศึกษาได้รับการปรับลด
ถึง 350 หน่วยต่อมิลลิลิตรซึ่งเป็นเช่นเดียวกับที่ของเห็ด
tyrosinase ตัวอย่างการทดสอบที่ความเข้มข้น 500 กรัม / มิลลิลิตร
ได้รับเลือกในการประเมินการยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase ใน B16F10 หมา
เซลล์เนื้องอก การดูดกลืนแสงวัดที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้
เครื่องอ่านแผ่น ELISA.
2.9 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium
ทดสอบโบรไมด์
ผลเป็นพิษของสารสกัดจากสมุนไพรหมัก
ถูกกำหนดด้วย 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2, 5-
diphenyltetrazolium โบรไมด์ (MTT) การทดสอบ ในการทดสอบ MTT ที่
succinate dehydrogenase กิจกรรมยลเป็นวัดที่เป็น
ตัวบ่งชี้ของเซลล์ที่มีชีวิตและการขยาย ในการศึกษาครั้งนี้
ทดสอบเซลล์มีชีวิตมีการปรับเปลี่ยนจากที่รายงานโดย Wodnicka
et al, (2000) CCD-966SK และ B16F10 เซลล์นับใช้
hemocytometer หลังจากการบ่มค้างคืนเซลล์ (5 × 106
เซลล์ / ดี) ถูกล้างโดยใช้สื่อที่สดและรับการรักษาด้วย
การควบคุมยานพาหนะ (กลางวัฒนธรรม) หรือสารสกัดจากสมุนไพรหมัก
เป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน เซลล์ที่ถูกบ่มแล้ว
1 กรัม / ลิตรของการแก้ปัญหา MTT นี้ (0.05 มิลลิลิตร) สำหรับ 4 ชั่วโมงในความมืดที่ 37 ◦Cใน
ศูนย์บ่มเพาะ CO2 5% ถัดไปกลางที่ถูกทิ้งอย่างระมัดระวัง
และ 0.1 มิลลิลิตร DMSO ถูกเพิ่มเข้าไปละลายผสม หลังจาก
ปฏิกิริยา 10 นาที, การดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวัด
ที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้โปรแกรมอ่าน microplate A (จาน Chameleon วี Hidex,
ฟินแลนด์) ปริมาณของเซลล์ที่มีชีวิตหลังการรักษาในแต่ละครั้งที่ได้รับการ
แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม.
2.10 การวิเคราะห์สถิติ
การทดสอบทั้งหมดถูกดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า การวิเคราะห์ความแปรปรวนและ
การทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรม SPSS (รุ่น
15.0) สำหรับ Windows ความแตกต่างของค่าเฉลี่ยได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญ
เมื่อ P <0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.8 . การทดสอบของ ไทโรซิเนส กิจกรรมใน b16f10 ~ เนื้องอกเซลล์ที่ถูกวัดโดยใช้กิจกรรมการยับยั้ง ไทโรซิเนสวิธีการพัฒนาโดย Peng et al . ( 2013 ) เซลล์ b16f10 คือที่เพาะเลี้ยงในขวดเพาะในตู้ CO2 ในบรรยากาศ humidifiedที่ประกอบด้วยคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในอากาศที่อุณหภูมิ 37 ◦ C และเสริมด้วยเซรั่มโปรตีน 10% fetal ( Sigma , USA ) เซลล์ ( 106 เซลล์ / มิลลิลิตร ) ได้แก่จากนั้นเมื่อผ่าน trypsinization และล้าง 3 ครั้ง ด้วยน้ำแข็งเย็นนี้ ฟอสเฟต เกลือ ถัดไป , เซลล์ที่ถูกรบกวนโดยsonication ที่ 4 ◦ C และแยกจากกันโดยการเหวี่ยงแยกที่ 15 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 25 นาที ปฏิกิริยาที่มีสมุนไพรผสมสารสกัดแอล โดปา 2 มก. / มล. และ 0.1 โมลาร์โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 )ถูกบ่มใน 96 ดีจานที่ 37 ◦ C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากค่าปริมาณโปรตีน และปรับความเข้มข้นด้วยการสลายบัฟเฟอร์จนแต่ละ lysate มีปริมาณที่เท่ากันของโปรตีน ( 40 กรัม ) ที่กิจกรรมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ไทโรซิเนสที่ใช้ในการศึกษาคือเจือจาง350 หน่วยต่อมิลลิลิตร ซึ่งเป็นเช่นเดียวกับที่ของเห็ดไท โรซิเนส . ทดสอบตัวอย่างที่ระดับความเข้มข้น 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรมีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสใน b16f10 ~เนื้องอกเซลล์ วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 nm ที่ใช้เป็นอ่านป้ายวิธีอีไลซ่า2.9 . 3 - ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl ) - 2,5-diphenyltetrazoliumการทดสอบโบรไมด์ต่อผลของสารสกัดสมุนไพรหมักตั้งใจกับ 3 - ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl ) - 2 , 5 -diphenyltetrazolium โบรไมด์ ( MTT ) ตามลำดับ ใน MTT assay ,กิจกรรมดีซิล วัดเป็นตัวบ่งชี้ของความมีชีวิตของเซลล์และการ . ในการศึกษานี้เซลล์ ( ดัดแปลงจาก wodnicka ที่รายงานโดยet al . ( 2000 ) การ ccd-966sk b16f10 cells และนับใช้เป็น hemocytometer . หลังจากบ่มค้างคืน เซลล์ ( 5 × 106 คนเซลล์ / ดี ) ล้างใช้สดขนาดกลาง และถือว่าการควบคุมรถ ( อาหารเลี้ยงเชื้อ ) หรือสารสกัดจากสมุนไพรหมักสำหรับ 72 ชั่วโมง ที่ความเข้มข้นต่างๆ เซลล์แล้วบ่ม1 g / L ของ MTT โซลูชั่น ( 0.05 ml ) สำหรับ 4 ชั่วโมงในที่มืดที่อุณหภูมิ 37 ◦ C ในเครื่องฟักไข่ CO2 5 % ต่อไปสื่อรอบคอบยกเลิก ,และ 0.1 มิลลิลิตร เติม solubilize DMSO ผสม หลังจาก10 นาที ปฏิกิริยา , การดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ถูกวัด540 nm ใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่านแผ่น hidex V , กิ้งก่า ,ฟินแลนด์ ) จํานวนเซลล์หลังการรักษาแต่ละครั้งก็ได้แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม2.10 . สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลการทดสอบทั้งหมดได้ดำเนินการทั้งสามใบ การวิเคราะห์ความแปรปรวนการทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้ SPSS ( รุ่น15.0 ) สำหรับ Windows หมายถึงความแตกต่างถูกถือว่าเป็นสําคัญเมื่อ p < 0.05